多枝賴(lài)草（Leymus multicaulis）鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、多枝賴(lài)草(Leymusmulticaulis〈Kar1&Kir1〉Tzvel1，2n=4X=28，XmXmNsNs)屬于小麥近緣屬賴(lài)草屬，分布于歐亞地區(qū)不同的生態(tài)環(huán)境下，我國(guó)主要分布于新疆地區(qū)，生長(zhǎng)于平原綠洲和鹽漬化荒漠草甸，具有突出的耐瘠薄、耐鹽堿性、耐寒性等特性。開(kāi)展多枝賴(lài)草抗逆分子生物學(xué)研究，分離耐鹽相關(guān)基因，對(duì)于農(nóng)作物的耐鹽育種具有重要意義。本研究以鹽脅迫下的多枝賴(lài)草葉片為材料，改良了多枝賴(lài)草葉片總RNA提取方法，建立了適合多枝

2、賴(lài)草的mRNA差異顯示體系，分離與分析耐鹽相關(guān)基因eDNA序列，克隆谷胱甘肽還原酶基因。結(jié)果如下： 采用四種方法提取多枝賴(lài)草葉片總RNA(異硫氰酸胍法、SDS法、CTAB法和TRIZOL試劑快速提取法)，結(jié)果表明：TRIZOL提取法提取的RNA產(chǎn)量較低，電泳呈現(xiàn)出28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA三條清晰的條帶，A260/A280為1.845，A260/A230為2.091，表明RNA的純度很高。而另外三種方法獲得的R

3、NA純度低，有降解現(xiàn)象。用TRIZOL法提取的RNA作為模板，可以擴(kuò)增出組成型Actin基因片段，表明提取的多枝賴(lài)草葉片總RNA能夠滿(mǎn)足分子生物學(xué)研究需要。 通過(guò)對(duì)退火溫度、模板用量、Taq酶和Mg2+濃度的優(yōu)化，建立了適合多枝賴(lài)草基因差異顯示的DDRT-PCR體系。選用26個(gè)隨機(jī)引物，分別與3個(gè)錨定引物組合成引物對(duì)，進(jìn)行鹽脅迫下多枝賴(lài)草mRNA差異顯示，獲得17個(gè)長(zhǎng)度在300～600bp的差異cDNA條帶，進(jìn)行序列測(cè)定及分析。

4、反Northern雜交分析篩選出11個(gè)陽(yáng)性片段。 GenBank/BLAST分析，DNA片段1編碼的蛋白與腺苷酸結(jié)合蛋白有29％的相似，這與DNA的表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)；cDNA片段2編碼的蛋白質(zhì)與與UMP/CMPkinase42％相似，UMP/CMPkinase與核苷酸的磷酸化有關(guān)，在信號(hào)傳導(dǎo)方面起作用；cDNA片段4編碼的蛋白質(zhì)與S9蛋白有49％的相似性，S9蛋白具有清除活性氧的功能，而活性氧是各種水分脅迫的主要傷害方式；可能與植物

5、的活性氧清除有關(guān)；該片段與GenBank中干旱脅迫二色高粱cDNA文庫(kù)一片段的核苷酸序列有99％的相似性，說(shuō)明該基因可能與水分逆境脅迫可能有較為密切的關(guān)系；cDNA5和10編碼的蛋白與轉(zhuǎn)錄修復(fù)因子35％的相似，與轉(zhuǎn)錄相關(guān)；DNA片段6編碼的蛋白與嗅感覺(jué)蛋白有21％的相似；cDNA片段11編碼的蛋白質(zhì)與來(lái)源于玉米的過(guò)氧化氫酶(catalase，EC1.11.1.6)34％一致，過(guò)氧化氫酶與鹽脅迫下過(guò)氧化傷害的清除有密切關(guān)系；cDNA13編

6、碼的蛋白質(zhì)與小麥鋁誘導(dǎo)蛋白wali3有60％的相似性；DNA片段14編碼的是一新的蛋白，在GenBank中無(wú)相似蛋白存在；DNA片段15編碼的蛋白與一個(gè)小結(jié)構(gòu)蛋白相似；cDNA片段17與β-香樹(shù)素合成酶基因53％相似，該酶是次生代謝物合成過(guò)程的一個(gè)酶。定量PCR表明DNA片段4和11與植物的耐鹽性有一定的相關(guān)性。 谷胱甘肽還原酶是植物體內(nèi)一類(lèi)重要的抗氧化酶。以多枝賴(lài)草葉片為材料，根據(jù)植物谷胱甘肽還原酶(GR)氨基酸保守區(qū)序列設(shè)計(jì)

7、簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增到1個(gè)408bp大小的cDNA片段(Genbank注冊(cè)號(hào)為AY781786)，5'RACE和3'RACE克隆獲得5'和3'端序列，拼接得cDNA基因全長(zhǎng)包含1580bp，包含一個(gè)1140bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼380個(gè)氨基酸。與水稻、玉米、煙草、葡萄、白菜、擬南芥大豆等植物谷胱甘肽還原酶氨基酸序列的同源性在77～92％之間。Southern印跡雜交表明多枝賴(lài)草谷胱甘肽還原酶基因在基因組中以單拷貝存在。

8、 Northern雜交和定量PCR分析多枝賴(lài)草GR基因在鹽脅迫下的表達(dá)，隨著鹽脅迫濃度的增加，GR基因表達(dá)加強(qiáng)，150mmol/L和300mmol/L處理時(shí)增加顯著。150mmol/LNaCl鹽脅迫下不同時(shí)間處理表明，GR基因隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)加強(qiáng)；處理24h時(shí)，GR基因表達(dá)水平最高。ABA(100mol/L)和干旱處理，GR基因也表現(xiàn)出與鹽處理相似的上調(diào)效應(yīng)，兩種實(shí)驗(yàn)方法研究多枝賴(lài)草GR基因在脅迫下的表達(dá)，可以得到一致的結(jié)果，G