牦牛重組干擾素表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、干擾素-α(interferon-α)和干擾素-β(interferon-β)屬于I型干擾素，分別由活化的白細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性；干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)為Ⅱ型干擾素，主要由活化的T淋巴細(xì)胞和NK(細(xì)胞產(chǎn)生，絲裂原以及抗原特異性刺激T淋巴細(xì)胞克隆也可產(chǎn)生，它具有廣泛抗病毒、抗細(xì)胞內(nèi)寄生菌及胞內(nèi)寄生蟲(chóng)、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。由于Ⅰ型、Ⅱ型干擾素

2、在疾病的診斷、治療、預(yù)防和疫苗免疫效果檢測(cè)等方面均具有重要作用，因此它是現(xiàn)代分子生物學(xué)、免疫學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。 本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆了牦牛干擾素-γ基因，并構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-yakIFN-Y，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)其晟佳誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行探索。結(jié)果表明：克隆的yakIFN-Y基因序列與GenBank上登錄的牛IFN-γ基因序列的同源性為99％；表達(dá)的最佳條件為：在LB培養(yǎng)基中28℃誘導(dǎo)5h，誘導(dǎo)

3、劑濃度為0.5mol/L。然后用鎳柱對(duì)可溶性表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析純化，包涵體經(jīng)DOC洗滌、SKL變性溶解、透析復(fù)性進(jìn)行純化；可溶性表達(dá)產(chǎn)物純化后用SDS-PAGE、Western-blot分析證實(shí)得到了高純度的重組yakIFN-γ。 在對(duì)牦牛干擾素-Ⅰ(yakIFN-a-A/Ⅱ和yakIFN-β)基因進(jìn)行改造后，選用近年來(lái)發(fā)展最快和最具潛能的真核表達(dá)系統(tǒng)一畢赤酵母對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)。首先分別構(gòu)建了這三個(gè)Ⅰ型干擾素基因的重組表達(dá)

4、載體pPIC9K-yakIFN-I(pPIC9K-yakIFN-α-A、pPIC9K-yakIFN-α-Ⅱ和pPIC9K-yakIFN-βB)用salⅠ內(nèi)切酶線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌種GS115，使重組表達(dá)載體與宿主酵母染色體發(fā)生同源整合，并用G418抗性梯度篩選法，獲得多拷貝重組菌株。對(duì)重組菌株利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)分泌表達(dá)，用SDS-PAGE分析表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)重組菌株分泌表達(dá)在72h時(shí)達(dá)高峰，分泌量可達(dá)180mg幾左右。 對(duì)純化的

5、yakIFN-Y和yakIFN-Ⅰ(yakIFN-α-A、yakIFN-α-Ⅱ和yakIFN-β)重組蛋白的生物學(xué)活性研究表明：重組牦牛IFN有誘導(dǎo)刺激淋巴細(xì)胞增殖能力，其中yaklFN-Y誘導(dǎo)刺激能力比yakIFN-I強(qiáng)；用yakIFN-Y和yakIFN-Ⅰ抗PRV生物活性研究發(fā)現(xiàn)。yakIFN-Ⅰ的抗病毒活性比yaklFN-Y強(qiáng)，同時(shí)yakIFN-α-A和yakIFN-β聯(lián)合使用比單獨(dú)使用抗PRV病毒活性強(qiáng)2倍，yakIFN-Y和y