狂犬病病毒M蛋白在桿狀病毒中的表達(dá)、純化及生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies Virus，RV）引起的一種人獸共患病。人和大多數(shù)溫血?jiǎng)游镆赘校R床上以怕光，精神沉郁，進(jìn)行性麻痹和最終死亡為主要特征，致死率幾乎100％。RV有N、P、M、G和L共5種結(jié)構(gòu)蛋白，其中，G蛋白是決定RV致病性的關(guān)鍵蛋白。許多研究表明G蛋白某些氨基酸位點(diǎn)的突變會(huì)改變RV的致病性以及病毒的一些生物學(xué)屬性，如胞間擴(kuò)散，膜融合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。而RV其它蛋白對(duì)其致病性是否有影響卻知之甚少。20

2、06年， Shimizu K等人利用反向遺傳學(xué)技術(shù)把Ni-CE（由固定毒株Nishigahara在雞胚成纖維細(xì)胞中連續(xù)傳100代后獲得的，對(duì)成年小鼠無(wú)致病性）M蛋白基因替換成Nishigahara株（固定毒株，腦內(nèi)接種可致死成年小鼠）M蛋白基因后，重組病毒CE（NiM）重新獲得了致病力，腦內(nèi)接種可致死成年小鼠。此結(jié)果為人們對(duì)RV致病機(jī)制的深入研究打開(kāi)了新的篇章。因此，從多個(gè)角度進(jìn)一步探討M蛋白對(duì)RV致病性的影響對(duì)于明確RV的致病機(jī)制和有

3、效防控狂犬病具有重要意義。
　　本研究以探討單獨(dú)的M蛋白接種對(duì)RV致病性的影響為目的，進(jìn)行了如下試驗(yàn)：
　　1．表達(dá)狂犬病病毒M蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建和鑒定。試驗(yàn)內(nèi)容：①以RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增狂犬病病毒BD06株M蛋白基因；②將M蛋白基因序列插入桿狀病毒載體質(zhì)粒pFastBac I中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac I-M；③用鑒定正確的重組質(zhì)粒pFastBac I-M轉(zhuǎn)化DH10 Bac E.coli感受態(tài)菌，構(gòu)建重組穿梭

4、質(zhì)粒Bacmid-M，并以PCR法鑒定；④以脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-M轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲取重組桿狀病毒AcMNPV-M，取細(xì)胞病變上清，以電鏡觀察重組病毒形態(tài)；⑤用小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體、兔抗RV陽(yáng)性血清和犬抗RV陽(yáng)性血清通過(guò)Western Blot方法鑒定重組M蛋白的表達(dá)及其反應(yīng)原性。
　　2．重組M蛋白的純化及多克隆抗體的制備。試驗(yàn)內(nèi)容：①利用鎳離子親和層析柱純化重組M蛋白

5、；②用純化的重組M蛋白免疫大耳白兔，每次免疫后1周，耳緣靜脈采血并分離血清；③通過(guò)Western Blot試驗(yàn)分析兔抗M蛋白多克隆抗體同狂犬病病毒aG株、PV2061株、SRV9株、CVS-11株、ERA株和BD06株M蛋白之間是否存在交叉反應(yīng)；④以FAVN試驗(yàn)測(cè)定兔抗M蛋白多克隆抗體是否具有病毒中和活性。
　　3．M蛋白生物學(xué)特性初步研究。以探索接種M蛋白后對(duì)腦內(nèi)與外周攻毒小鼠潛伏期、發(fā)病率的影響為目的。具體試驗(yàn)步驟如下：①將實(shí)

6、驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為腦內(nèi)攻毒組和外周攻毒組兩個(gè)大組，兩組中又分別設(shè)立了高劑量攻毒組和低劑量攻毒組；②將純化的M蛋白與等體積油佐劑混合后分別于0d，7d，14d通過(guò)腹腔注射免疫四個(gè)大組中的小鼠，同時(shí)大組內(nèi)設(shè)立透析液組、AcMNPV組作為對(duì)照；③第3次免疫后，于第5天對(duì)小鼠進(jìn)行斷尾采血并分離血清，用Western Blot試驗(yàn)分析重組M蛋白免疫原性；④第3次免疫后1周，對(duì)兩大組小鼠分別進(jìn)行腦內(nèi)和外周肌肉注射攻毒試驗(yàn)，攻毒后連續(xù)觀察14天，記錄小鼠

7、攻毒后的潛伏期、發(fā)病數(shù)以及死亡數(shù)。
　　通過(guò)以上試驗(yàn)，獲得以下結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了重組桿狀病毒AcMNPV-M，且該重組病毒電鏡下具有典型的桿狀病毒形態(tài)，其感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞后，通過(guò)SDS-PAGE試驗(yàn)鑒定，重組桿狀病毒表達(dá)了一約25kD的蛋白，用小鼠抗His標(biāo)簽單抗、兔抗RV陽(yáng)性血清和犬抗RV陽(yáng)性血清通過(guò)Western Blot試驗(yàn)對(duì)其反應(yīng)原性鑒定，在25kD附近也出現(xiàn)了單一的條帶。
　　2.變性條件下純化的重

8、組M蛋白SDS-PAGE條帶單一，純度良好；透析復(fù)性后，以該純化M蛋白免疫大耳白兔制備的兔抗M蛋白多克隆抗體與現(xiàn)有主要狂犬病疫苗株及流行毒株M蛋白反應(yīng)性能良好，Western Blot鑒定結(jié)果顯示在25 kD左右均出現(xiàn)了一特異性條帶；FAVN試驗(yàn)結(jié)果顯示，兔抗M蛋白多克隆抗體的病毒中和效價(jià)為0。
　　3.小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)接種M蛋白后，腦內(nèi)接種3 LD50或50 LD50狂犬病病毒CVS-24株時(shí)，不同小組動(dòng)物的潛伏期、發(fā)

9、病和死亡率均無(wú)明顯差異；外周接種100 LD50狂犬病病毒BD06株時(shí)，AcMNPV-M組的小鼠全部發(fā)病，透析液組和AcMNPV組小鼠死亡率為80%（8/10）；外周接種3 LD50狂犬病病毒BD06株時(shí)，AcMNPV-M組、透析液組和AcMNPV組的小鼠均無(wú)發(fā)病。
　　通過(guò)以上研究結(jié)果，得出以下結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了重組桿狀病毒AcMNPV-M，且該重組病毒表達(dá)的M蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為后續(xù)研究M蛋白其它生物學(xué)特性

10、奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　2.可用鎳離子親和層析法對(duì)桿狀病毒表達(dá)的M蛋白進(jìn)行純化；重組M蛋白免疫原性良好；制備的兔抗M蛋白多克隆抗體與現(xiàn)有狂犬病疫苗株及流行毒株均有良好反應(yīng)性；M蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體無(wú)病毒中和活性。
　　3.單獨(dú)的M蛋白接種對(duì)不同組別中腦內(nèi)攻毒小鼠的潛伏期、發(fā)病率和死亡率的均無(wú)明顯影響；對(duì)不同劑量外周攻毒的小鼠的潛伏期也無(wú)明顯影響，但有提升小鼠的發(fā)病率的趨勢(shì)。提示單獨(dú)接種M蛋白可能會(huì)影響狂犬病病毒致病性。