家蠶絲素重鏈基因敲除品系的建立及其應(yīng)用.pdf

1、家蠶因其強(qiáng)大的泌絲吐絲能力而蜚聲古今中外，在長(zhǎng)達(dá)數(shù)千年的飼養(yǎng)和馴化中為世界經(jīng)濟(jì)和文化交流做出了重要的貢獻(xiàn)。蠶絲纖維是復(fù)雜的蛋白質(zhì)微細(xì)纖維的集合體，具有優(yōu)良的光澤、色調(diào)、手感而且在吸濕性、吸氣性、對(duì)皮膚的親和性等許多方面具有出色的性能。然而蠶絲也有不耐磨、易黃化褪色等缺點(diǎn)，且強(qiáng)度也不如蜘蛛絲等纖維。因此如何改造蠶絲，使蠶絲獲得高繭絲強(qiáng)度、強(qiáng)延伸性、易染色、高肌膚親和性等優(yōu)質(zhì)性能一直是一個(gè)研究難題。
　　 由于家蠶是經(jīng)過(guò)數(shù)千年選育出

2、來(lái)的，普通的遺傳育種方法已很難改變其蠶絲特性，而蠶絲絲素重鏈的的高表達(dá)量、高度重復(fù)序列和高分子量使得用常規(guī)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)也難以對(duì)其進(jìn)行研究和改造。近些年發(fā)展起來(lái)的鋅指核酸酶(zincfingernuclease，ZFN)技術(shù)由于其能特異性的識(shí)別靶向基因的DNA序列，并造成DNA的雙鏈斷裂(DSB)進(jìn)而刺激機(jī)體自身的修復(fù)途徑，通過(guò)同源重組(Homologousrecombina-tion，HR)和非同源性末端鏈接(Non-homologou

3、sendjoining，NHEJ)兩種方式實(shí)現(xiàn)靶向基因的敲除和敲入。目前，這一技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于動(dòng)植物的基因敲除和定點(diǎn)改造之中。
　　 本研究以絲素重鏈基因?yàn)榘袠?biāo)，利用新近發(fā)展起來(lái)的鋅指核酸酶技術(shù)，以多化性家蠶品種“N4”和滯育性家蠶品種“大造”為顯微注射材料，高效的對(duì)家蠶絲素重鏈基因進(jìn)行了敲除，首次獲得了包括在絲素重鏈基因N端非重復(fù)區(qū)域部分缺失、部分堿基突變或小片段插入的一系列突變家蠶品系。并完成了突變位點(diǎn)的測(cè)序分析、絲腺的

4、表型觀察及突變蠶繭與野生型家蠶蠶繭的比較分析;在絲素重鏈突變品系中高量表達(dá)了綠色熒光蛋白，不但為家蠶絲蛋白基因的遺傳改良提供了一種全新的思路和方法，也為利用家蠶絲腺作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白提供了有價(jià)值的參考。獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)對(duì)家蠶絲素重鏈基因的序列特征進(jìn)行分析，及其在不同蠶品系中SNP分布情況，以及結(jié)合鋅指蛋白識(shí)別DNA序列的特性，我們選擇CTGTTGCTCAAAGTTATGTTGCTGCTGATGCGGG

5、AGCA作為鋅指核酸酶識(shí)別的靶位點(diǎn)，該靶位點(diǎn)位于家蠶絲素重鏈基因的N端非重復(fù)區(qū)域，并據(jù)此設(shè)計(jì)和合成針對(duì)絲素重鏈基因的靶向敲除的鋅指核酸酶載體。
　　 2.我們將合成的FibH-ZFN的mRNA注射了多化性家蠶品種“N4”和滯育性家蠶品種“大造”兩個(gè)品種，分別在G1代的29和38個(gè)蛾圈中發(fā)現(xiàn)250和105頭突變體，其表型出現(xiàn)裸蛹或者繭層稀薄的“絲膠繭”。
　　 3.從篩選的突變體中選取117個(gè)表現(xiàn)型均為裸蛹或“絲膠繭”的突

6、變個(gè)體進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明所選取的117個(gè)突變個(gè)體在鋅指核酸酶靶位點(diǎn)均發(fā)生了突變，具體序列如SEQIDNO:2-118，這些突變包括變異、缺失和小片段的插入。
　　 4.解剖突變品系的家蠶和野生型家蠶，觀察他們絲腺，發(fā)現(xiàn)突變品系的絲腺明顯小于正常家蠶的絲腺，其后部絲腺也出現(xiàn)退化現(xiàn)象;比較它們的繭絲的細(xì)薄、繭層的厚度及繭絲的重量，突變品系都要小于野生型家蠶的繭絲;通過(guò)蛋白電泳對(duì)繭絲成分的分析，發(fā)現(xiàn)突變品系的繭絲不含絲素蛋白，