蛻皮甾酮對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、背景：自從間充質(zhì)干細(xì)胞于1966年被Friedenstein從骨髓中發(fā)現(xiàn)開始,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在一定的條件下具有向內(nèi)、中、外三個(gè)胚層分化的能力,其中包括分化為骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的潛能,可以廣泛參與組織器官損傷的修復(fù)過程,成為組織工程和干細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其中骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)憑借易于培養(yǎng)擴(kuò)增、遺傳背景相對(duì)穩(wěn)定且多向分化特性不受影響等特性,被廣泛用于細(xì)胞及組

2、織多種疾病的替代治療。但隨著對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)成年動(dòng)物骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量及增殖、分化潛能隨年齡的增大而不斷下降,且供者間充質(zhì)干細(xì)胞的采集須行骨髓穿刺術(shù),由于疾病的原因,病人常有感染、體質(zhì)較弱等因素也限制了自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的廣泛應(yīng)用。因此尋找新的間充質(zhì)干細(xì)胞來源是近年來國內(nèi)外干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)之一。1991年,McElreavey等首次報(bào)道,從人臍帶的WJ組織中分離并培養(yǎng)到了一種成纖維樣細(xì)胞,具有較高的分化潛能。

3、隨后,數(shù)位研究者也分別報(bào)道從WJ中分離到豐富的MSCs。通過大量體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí),特定條件下其同樣具有成骨、成軟骨、成脂肪、成肌肉、成血管內(nèi)皮、成神經(jīng)細(xì)胞等多向分化能力,通過和其他來源MSCs特別是和作為MSCs金標(biāo)準(zhǔn)的BMSCs相比,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有巨大優(yōu)勢(shì):首先,來源廣泛,取材方便,供者無痛苦；其次,相對(duì)純凈,污染機(jī)會(huì)少；第三,含量豐富,較為原始,增殖分化能力強(qiáng),免疫原性低,生物性能穩(wěn)定,可以為實(shí)驗(yàn)和臨床提供充足的細(xì)胞來源。因此

4、,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞有望成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代來源,成為近來基礎(chǔ)研究與臨床廣泛研究的熱點(diǎn)。科研人員和公眾均寄希望通過間充質(zhì)干細(xì)胞領(lǐng)域的研究治愈諸如難愈性創(chuàng)面,多臟器損傷,心肌梗死等傳統(tǒng)方式治療效果欠佳的疾病。盡管目前間充質(zhì)干細(xì)胞治療在臨床上的效果尚未得到完全確證,還是有越來越多的國家正加入此項(xiàng)研究。然而,間充質(zhì)干細(xì)胞治療要想真正從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用還面臨著諸多挑戰(zhàn),尚有很多關(guān)鍵性問題亟待解決。特別是間充質(zhì)干細(xì)胞體外的生物學(xué)特性研究

5、至關(guān)重要,是其臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)及前提。
　　 蛻皮甾酮(EDS),是一種調(diào)控昆蟲蛻皮過程的激素,廣泛存在于眾多植物類群及動(dòng)物類群中,結(jié)構(gòu)類似于雌二醇,實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能夠有效促進(jìn)哺乳動(dòng)物的多種組織和器官的核酸與蛋白質(zhì)的合成及糖和脂類代謝。由于該類物質(zhì)來源廣泛,生物學(xué)特性復(fù)雜,因此吸引了許多學(xué)者投身其研究工作。Otaka等報(bào)道羥基蛻皮甾酮無論體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)均可迅速刺激大鼠肝臟蛋白的合成。體外實(shí)驗(yàn)中,羥基蛻皮甾酮能夠通過促進(jìn)合成,進(jìn)而增強(qiáng)

6、微粒體和核糖體的蛋白合成能力。Yoshida T等報(bào)道了蛻皮甾酮對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)效應(yīng),預(yù)先腹腔注射羥基蛻皮甾酮能夠?qū)垢骨蛔⑸湟雀哐撬丶办o脈注射抗胰島素引起的高血糖癥。Syrov VN等報(bào)道蛻皮甾醇具有保護(hù)肝臟的作用。隨著研究的不斷深入,蛻皮甾酮更多的生物學(xué)特性將被揭示出來。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)EDS具有促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)創(chuàng)傷皮膚愈合,促進(jìn)表皮及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖等作用。最新研究表明,特定條件下甾體類激素地塞米松具有誘導(dǎo)h

7、UCMSCs分化為骨細(xì)胞并表達(dá)骨橋蛋白、涎蛋白、骨連接素等骨性標(biāo)志物的能力,且可在黏多糖的基質(zhì)上形成類似于關(guān)節(jié)軟骨的球狀骨針,可有效誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,同屬甾體類物質(zhì)的蛻皮甾酮表現(xiàn)出的生物多效性,提示其對(duì)促臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)分化等方面有一定的影響,最新研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)劑作用后可有效治療骨質(zhì)疏松等疾病,EDS能否誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化尚不明確,進(jìn)行此項(xiàng)研究具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 目的：分離培養(yǎng)并

8、鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUCMSCs),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的種子細(xì)胞。
　　 方法：采用酶消化法及組織塊培養(yǎng)法分離出hUCMSCs,通過培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增,從而獲取相對(duì)均一、足夠數(shù)量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。取第3代hUCMSCs通過細(xì)胞流式學(xué)檢測(cè)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面特異性標(biāo)志CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105及多向分化能力

9、加以鑒定。取第3、7代hUCMSCs繪制細(xì)胞生長曲線,并觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.hUCMSCs的形態(tài)學(xué)觀察:倒置顯微鏡下觀察,酶消化法所得細(xì)胞,原代接種24 h可見有少量細(xì)胞貼壁,外觀呈紡錘形和短棒形,并可見細(xì)胞核。培養(yǎng)至5d左右細(xì)胞大部為雙突起的長梭形、扁平形生長,核仁較前明顯。培養(yǎng)至10d左右,細(xì)胞形態(tài)變?yōu)闉榈湫偷某衫w維細(xì)胞形態(tài),當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)予以消化、傳代。傳代培養(yǎng)至P3后可出現(xiàn)明顯的

10、單一細(xì)胞集落。從原代培養(yǎng)來看,膠原酶消化法比組織塊培養(yǎng)法的效率更高,大約10d就可以進(jìn)行傳代,而組織塊培養(yǎng)法要14d才能傳代,形態(tài)學(xué)變化及之后的傳代兩者之間沒有顯著性差別。
　　 2.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè):CD34陽性率為7.54％,CD45陽性率為5.35％,CD29陽性率為98.45％,CD44陽性率為97.83％,CD90陽性率為97.36％,CD105陽性率為99.20％.
　　 3.hUCMSCs體外多向誘導(dǎo)分化:<

11、br>　　 3.1 hUCMSCs成骨誘導(dǎo)的形態(tài)變化及功能鑒定:成骨誘導(dǎo)5d左右,細(xì)胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)槿切位蚨嘟切蔚?。高倍顯微鏡下觀察可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含顆粒樣物質(zhì)。誘導(dǎo)10d,細(xì)胞胞質(zhì)中及胞質(zhì)外均可見較多細(xì)小黑色顆粒,胞核顏色較淡,胞質(zhì)色變深。3W時(shí)細(xì)胞生長密集,中央可見類似結(jié)節(jié)狀的結(jié)構(gòu),部分細(xì)胞呈現(xiàn)層疊樣生長。堿性磷酸酶及茜素紅染色顯示強(qiáng)陽性,符合成骨細(xì)胞的特征。說明hUCMSCs在體外具有向成骨細(xì)胞分化的潛能。
　　 3

12、.2 hUCMSCs成脂誘導(dǎo)的形態(tài)變化及功能鑒定:成脂誘導(dǎo)7d左右,細(xì)胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)槎讨?；在誘導(dǎo)約14d時(shí)細(xì)胞變?yōu)闄E圓形、圓形；20d時(shí)胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴形成,油紅“O”染色呈強(qiáng)陽性。表明hUCMSCs在體外具有向脂肪細(xì)胞分化的潛能。
　　 4.hUCMSCs生長曲線:hUCMSCs生長曲線呈“S”形,接種后第1～2天為潛伏適應(yīng)期,從第3天起細(xì)胞開始增殖并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,第5天達(dá)到高峰,7天以后進(jìn)入平臺(tái)期。根據(jù)生長曲線可知

13、hUCMSCs的群體倍增時(shí)間約為24h。增殖曲線顯示本實(shí)驗(yàn)中P3、P7代細(xì)胞增殖速率無顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.hUCMSCs可通過酶消化法及組織塊培養(yǎng)法體外分離、純化培養(yǎng),細(xì)胞生長穩(wěn)定,可連續(xù)傳代。組織塊培養(yǎng)法的原代培養(yǎng)時(shí)間為14～16 d,培養(yǎng)時(shí)間較長,而采用膠原酶消化法可快速獲得大量貼壁生長的MSCs,且操作簡(jiǎn)便易行,可更好地保持細(xì)胞活力,大大縮短了原代培養(yǎng)時(shí)間。
　　 2.經(jīng)流式紐胞儀檢測(cè),hU

14、CMSCs均一地高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD29、CD44、CD90、CD105,陰性表達(dá)造血系標(biāo)志CD34、CD45,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,hUCMSCs與其他組織來源的MSCs流式檢測(cè)表型一致。
　　 3.經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后,通過ALP染色以及茜素紅染色證實(shí)分化為成骨細(xì)胞,通過油紅“O”染色證實(shí)分化為脂肪細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)證實(shí)分離所得hUCMSCs具有多向分化能力。
　　 4.hUCMSCs隨著傳代次數(shù)增加增殖能力未見顯著降低

15、。
　　 目的：觀察凍存復(fù)蘇后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUCMSCs)的復(fù)蘇率及增值活性,探討液氮長期保存間充質(zhì)細(xì)胞的可行性。
　　 方法：參照前面方法體外分離培養(yǎng)獲得原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,采用改良分階段凍存方法,5個(gè)月后復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng),觀察比較各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞成活率和MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值能力的差異,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凍存細(xì)胞的表型變化。
　

16、　 結(jié)果：
　　 1.復(fù)蘇hUCMSCs的形態(tài)學(xué)特征。復(fù)蘇后細(xì)胞2h即開始貼壁,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮渭岸嘟切?。?fù)蘇細(xì)胞一周左右即可傳代,傳至第3代時(shí),細(xì)胞形態(tài)與正常培養(yǎng)對(duì)照組無明顯差別。
　　 2.流式細(xì)胞檢測(cè)復(fù)蘇hUCMSCs符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征。MTT法檢測(cè)顯示低溫凍存并沒有降低間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性。
　　 結(jié)論：通過檢測(cè)凍存復(fù)蘇細(xì)胞的存活率,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志未發(fā)生改變,表明液氮凍存法可長期保存間充

17、質(zhì)干細(xì)胞；另外,恰當(dāng)選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞凍存,且凍存細(xì)胞濃度應(yīng)達(dá)到1×106/ml,對(duì)于保證凍存成功同樣起著關(guān)鍵作用。
　　 目的：觀察蛻皮甾酮(Ecdysterone,EDS)對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilicalcord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)體外增殖的影響,并探討其促進(jìn)細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。
　　 方法：取第3代hUCMSCs分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(低糖DMEM培養(yǎng)基、

18、10％的胎牛血清、100U/m青/鏈霉素、4mmol/L L-谷氨酰胺)中加入不同濃度(0、25、50、100、150、200μg/ml)EDS予以干預(yù),分別于第1、3、5、7天行MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；另外,設(shè)置相同分組EDS干預(yù)培養(yǎng)hUCMSCs7天,繪制細(xì)胞生長曲線,觀察比較細(xì)胞增殖差異。經(jīng)細(xì)胞流式儀測(cè)定不同分組細(xì)胞周期,觀察增殖期細(xì)胞所占比例。對(duì)數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果：
　　 1、MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)

19、EDS干預(yù)培養(yǎng)的hUCMSCs增殖能力較空白對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05),其中EDS100μg/ml、150μg/ml及200μg/ml三組細(xì)胞活性比較無顯著差異(P＞0.05),較其他實(shí)驗(yàn)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、細(xì)胞生長曲線同樣顯示EDS實(shí)驗(yàn)組可有效促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。其中EDS100μg/ml實(shí)驗(yàn)組促增殖效果最明顯,EDS100μg/ml、150μg/ml及200μg/ml三組未見顯著性差異。

20、r>　　 3、流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞周期顯示:EDS100μg/ml、150μg/ml及200μg/ml三組細(xì)胞S期細(xì)胞所占比例最大,與其他實(shí)驗(yàn)組比較有顯著差異,同時(shí)三組細(xì)胞的增殖指數(shù)也顯著高于對(duì)照組。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證實(shí)體外條件下,EDS在一定濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)hUCMSCs增殖的作用,該作用具有一定的濃度依賴性,當(dāng)EDS濃度為100μg/ml促增殖作用達(dá)到最佳效果,初步機(jī)制認(rèn)為EDS主要是通過改變細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖。

21、
　　 目的：觀察蛻皮甾酮(Ecdysterone,EDS)對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilicalcord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)成骨分化的影響。
　　 方法：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)鑒定,取第5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分別在基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度EDS和地塞米松予以干預(yù),分別于第1、3、5、7天MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率；另外,設(shè)置相同的分組誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后,行茜素

22、紅及堿性磷酸酶鈣鈷法染色鑒定細(xì)胞成骨分化能力,計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT檢測(cè)顯示一定范圍內(nèi)EDS在基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,濃度增高至200μg/ml對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)抑制作用,地塞米松對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。
　　 2.茜素紅及堿性磷酸酶鈣鈷法染色鑒定顯示基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞染色陰性,EDS及地塞米松組實(shí)驗(yàn)組均可以誘導(dǎo)hUCMSCs鈣化結(jié)節(jié)形成,比較發(fā)現(xiàn)EDS200μg/ml組細(xì)胞陽