茄子黃萎病防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)miR395的功能研究.pdf

1、由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起的茄子黃萎病是一種植物土傳性質(zhì)的維管束病害，它能引起起植物的葉片枯萎，最后導(dǎo)致植物死亡。關(guān)于黃萎病的致病機制，到目前為止還不完全了解。microRNA(miRNA)是一類長度約為22 nt的非編碼RNA,在植物的生長發(fā)育或脅迫反應(yīng)中起著非常重要的調(diào)控作用。miR395是與植物營養(yǎng)硫缺陷脅迫有關(guān)的miRNA，而硫營養(yǎng)又與植物抗病蟲害能力緊密相關(guān)。本論文以茄子miR395為研究對象

2、，通過大麗輪枝菌脅迫下表達模式分析、在茄子中過表達分析、轉(zhuǎn)基因茄子的抗病性分析以及相關(guān)生理生化指標(biāo)分析，探究miR395在抗病中的作用。本研究得到的主要結(jié)果如下:
　　1.miR395在大麗輪枝菌誘導(dǎo)下的表達模式。利用熒光定量qRT-PCR對miR395及其預(yù)測靶基因FS072237進行分析，結(jié)果顯示，miR395成熟體基因隨著侵染時間的延長是成逐漸下調(diào)趨勢的，而其預(yù)測靶基因FS072237的表達呈逐漸上調(diào)趨勢，與miR395的表

3、達呈負(fù)相關(guān)，這表明miR395可能參與響應(yīng)植物對黃萎病的防衛(wèi)反應(yīng)，也表明其預(yù)測靶基因可能是miR395真正靶基因。
　　2.miR395前體基因的克隆、表達載體構(gòu)建與茄子遺傳轉(zhuǎn)化。由于目前茄子的核酸序列庫相對較小，通過生物信息學(xué)分析尚未在茄子中找到miR395前體序列，而miR395成熟序列在植物各物種之間序列保守，為了研究miR395在茄子黃萎病中的作用，我們采用PCR方法從擬南芥中克隆到了miR395前體基因，并隨后構(gòu)建了過表

4、達載體，接著將構(gòu)建好的過表達載體轉(zhuǎn)化到茄子“蘇琦1號”品種(Solanum melongena L.cv.Suqi)中，通過PCR、qRT-PCR分析，鑒定得到4個過表達茄子株系。
　　3.轉(zhuǎn)miR395基因植株黃萎病的抗病性鑒定。采用大麗輪枝菌浸染方法處理轉(zhuǎn)基因茄子植株，并以野生型作為對照，結(jié)果顯示，與野生型對照相比，過表達miR395的轉(zhuǎn)基因茄子植株對大麗輪枝菌的侵染變得更加敏感，無論病情指數(shù)還是發(fā)病率，過表達轉(zhuǎn)基因株系，都明

5、顯高于對照植株。因為谷胱甘肽是硫轉(zhuǎn)運的終端，檢測了谷胱甘肽在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它在大麗輪枝菌的侵染下在植物體內(nèi)呈早期明顯上升，后期下降的趨勢。這與小麥-白粉菌中GSH的變化一致。
　　4.抗病相關(guān)的生理化指標(biāo)分析。分別檢測了超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性，結(jié)果顯示，在開始階段轉(zhuǎn)基因茄子體內(nèi)SOD、POD含量較低,但隨著黃萎病菌侵染，野生型體內(nèi)各種酶的活性快速增加，其幅度高于轉(zhuǎn)基因植株;說明，