升清降糖合劑對(duì)STZ誘導(dǎo)RINm5F細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、隨著人民生活水平的提高、生活模式的改變及社會(huì)老齡化，糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。由于其發(fā)病率高，病程長(zhǎng)，并發(fā)癥多見(jiàn)，因而導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量降低，也帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)重?fù)?dān)。目前研究表明，中醫(yī)藥治療糖尿病有很好的療效，可以改善臨床癥狀。升清降糖合劑經(jīng)中醫(yī)臨床實(shí)踐檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有很好的改善糖尿病患者全身的狀況，提高生活質(zhì)量。為了進(jìn)一步研究其機(jī)理，我們從保護(hù)胰島細(xì)胞入手，了解其抗細(xì)胞凋亡的作用，并探討其保護(hù)胰島細(xì)胞的可能機(jī)理，為臨床用藥和糖尿病的治療

2、提供新的思路。
　　 目的：
　　 1．觀察升清降糖合劑(SQ)對(duì)胰島β細(xì)胞損傷模型活性的影響；
　　 2．探討升清降糖合劑對(duì)細(xì)胞凋亡率、對(duì)細(xì)胞上清液中NO含量的影響，揭示其抗凋亡和抗氧化的作用；
　　 3．研究SQ對(duì)NFκB的影響，揭示調(diào)節(jié)免疫和抗凋亡的信號(hào)通路；
　　 4．探索SQ抗糖尿病的可能分子機(jī)制；
　　 方法：
　　 1．稱(chēng)取原方比例升清降糖合劑(SQ)，研末，過(guò)篩，以

3、半仿生提取法設(shè)計(jì)提取條件，常壓下加熱回流提取，合并三次煎液，過(guò)濾旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，即得復(fù)方有效成分；
　　 2．利用不同濃度和時(shí)間STZ誘導(dǎo)大鼠胰島細(xì)胞瘤株(RINm5F)損傷，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，以達(dá)到IC50做為干預(yù)條件，確定損傷模型的成功；
　　 3．以PBS配成不同濃度SQ，干預(yù)正常細(xì)胞，以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率，確定SQ對(duì)正常細(xì)胞的作用；
　　 4．以PBS配成不同濃度SQ，干預(yù)模型組細(xì)胞，以C

4、CK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率，并用倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察，確定SQ的最佳保護(hù)劑量；
　　 5．分模型組(STZ)、保護(hù)組(SQ+STZ)、正常組(PBS)，分別干預(yù)24h，紫外光分光光度法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的NO的含量，細(xì)胞流式檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，免疫熒光檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子NFκB表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1．SQ的提取：以半仿生提取法成功提取復(fù)方有效成分，重復(fù)性好。
　　 2．胰島β細(xì)胞氧化損傷模型的建

5、立：CCK-8法檢測(cè)顯示RINm5F增殖率隨STZ干預(yù)濃度的增長(zhǎng)而減少，呈直線(xiàn)負(fù)相關(guān)，P＜0.01，我們確定IC50即0.8mmol·L-1STZ干預(yù)24h為細(xì)胞損傷模型條件。
　　 3．不同濃度的SQ對(duì)正常細(xì)胞活性影響：CCK-8法檢測(cè)不同濃度SQ加入正常組24h的細(xì)胞增殖率。與正常組比較，加入SQ組的細(xì)胞增殖率無(wú)明顯影響(P＞0.05)。
　　 4．SQ最佳保護(hù)濃度的確立：CCK-8法檢測(cè)不同濃度SQ加入模型組24h

6、的細(xì)胞增殖率。其中400μg·ml-1SQ組較模型組活性明顯升高，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，且低濃度SQ對(duì)照組(100μg·m1-1)及中濃度SQ對(duì)照組（200μg·ml-1）對(duì)細(xì)胞活性影響不大(P＞0.05)，故以400μg·ml-1SQ組為保護(hù)治療劑量。
　　 5．細(xì)胞凋亡率：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率提示模型組(13.3±2.21％)與陰性組比較，差異顯著(P＜0.01)，與保護(hù)組(6.58±1.12％)有顯著差異(P＜

7、0.01)。
　　 6．細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量測(cè)定：硝酸還原法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量，與正常組(170.571±7.23)比較，模型組(208.12±4.85)NO的含量明顯上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異水平(P＜0.05)。與模型組比較，保護(hù)組(175.30±4.10)中NO含量下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 7．核轉(zhuǎn)錄因子NFκB熒光表達(dá)：模型組與正常組及保護(hù)組比較比較，在細(xì)胞胞內(nèi)NFκB熒光表達(dá)下降，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差

8、異；而在細(xì)胞核內(nèi)，明顯的可見(jiàn)模型組細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)較正常組增強(qiáng)。保護(hù)組與模型組比較，細(xì)胞核內(nèi)NFκB熒光表達(dá)減弱。
　　 結(jié)論：
　　 1．半仿生提取法高效的保持了中醫(yī)復(fù)方的有效成分，具有良好的穩(wěn)定性和可行性，操作可重復(fù)性強(qiáng)，值得進(jìn)一步工藝研究；
　　 2．一定濃度的STZ可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，造成胰島β造成氧化損傷，可能與NO對(duì)細(xì)胞毒性有關(guān)，并可能與核轉(zhuǎn)錄因子NFκB激活有關(guān)；
　　 3．一定劑量SQ可保護(hù)