稻瘟病菌兩個(gè)致病相關(guān)基因ZNF1和CKS1的鑒定及生物學(xué)功能分析.pdf

1、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病(rice blast)是水稻上的重要病害，每年可造成10-30％的稻谷產(chǎn)量損失，嚴(yán)重威脅世界水稻種植和糧食安全。由于經(jīng)濟(jì)的重要性和分子遺傳的可操作性，稻瘟病菌-水稻互作機(jī)制已成為研究病原菌-寄主植物互作的模式系統(tǒng)。對(duì)稻瘟病菌致病分子機(jī)理的深入了解不僅有利于病害防治策略的研發(fā)，而且對(duì)其它植物病原真菌致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)具有指導(dǎo)意義。本文通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化和生物信息學(xué)分析鑒

2、定了2個(gè)稻瘟病菌致病相關(guān)基因:ZNF1和CKS1。通過(guò)基因敲除、表型分析、熒光標(biāo)記、酵母雙雜交等分子生物學(xué)技術(shù)分析了ZNF1和CKS1在稻瘟病菌形態(tài)發(fā)育和致病過(guò)程中的作用，主要研究結(jié)果如下:
　　1.建立了T-DNA插入突變體庫(kù)，獲得了XF696等5個(gè)致病缺陷突變體
　　為獲得與稻瘟病菌致病相關(guān)新基因，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次ATMT轉(zhuǎn)化，共獲得2200個(gè)T-DNA插入突變體。其中5個(gè)突變體(XF577，XF696，XF1379，X

3、F1521，XF1557)對(duì)寄主的致病性完全喪失。Tail-PCR以及生物信息學(xué)分析明確了5個(gè)突變體的T-DNA標(biāo)記基因分別為BUF1(MGG_02252)，MGG_14931，STU1(MGG_00692),MKK2(MGG_06482),MST12(MGG_12958)。其中XF696的T-DNA標(biāo)記基因MGG_14931的生物學(xué)功能尚未報(bào)道。
　　2.ZNF1在稻瘟病菌附著胞發(fā)育、成熟以及侵染過(guò)程中有重要作用
　　XF

4、696突變體中T-DNA標(biāo)記基因MGG14931編碼一個(gè)假定的C2H2鋅指蛋白，將該基因命名為ZNF1(Maganporthe oryzaezinc finger protein)。ZNF1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有兩種不同的剪切形式:SⅠ和SⅡ，SⅠ為主要剪切方式，并具有正常功能，而SⅡ沒(méi)有功能?；蚯贸?、互補(bǔ)、表型分析及qRT-PCR等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1)敲除ZNF1不影響稻瘟病菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、色素沉積以及有性生殖;2）Δznf1產(chǎn)孢能力顯著增加，

5、說(shuō)明ZNF1可能負(fù)調(diào)控分生孢子的形成;3）Δznf1突變體對(duì)大麥和水稻的致病性完全喪失，即使在劃傷或針刺的大麥和水稻葉片表面都不能產(chǎn)生病斑;4）Δznf1突變體芽管頂端可以分化形成膨大結(jié)構(gòu)，但是不能形成正常的附著胞，也不能穿透寄主表皮;5）外源cAMP或IBMX能夠誘導(dǎo)Δznf1突變體分生孢子在親水或疏水表面上產(chǎn)生囊泡狀的膨大結(jié)構(gòu)。但外源添加cAMP或IBMX不能完全恢復(fù)Δznf1附著胞形成缺陷;6）qRT-PCR以及GFP熒光檢測(cè)表明

6、，稻瘟病菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢階段ZNF1表達(dá)水平較低，而附著胞發(fā)育與成熟階段ZNF1表達(dá)水平顯著升高。在突變體Δpmk1中，ZNF1表達(dá)水平受到抑制。表明ZNF1在附著胞發(fā)育階段表達(dá)水平受Pmk1 MAPK信號(hào)途徑調(diào)控;7）Nile Red和I2/KI染色表明，ZNF1參與附著胞形成過(guò)程中脂滴和糖原的移動(dòng)以及降解;8）H1-RFP標(biāo)記顯示Δznf1附著胞形成過(guò)程中，芽管尖端能進(jìn)行多次有絲分裂，但細(xì)胞核不被降解，細(xì)胞自噬性降解過(guò)程受阻;9）結(jié)

7、構(gòu)域缺失和點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)顯示3個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)以及核定位信號(hào)序列(NLS)對(duì)Znf1蛋白功能起重要作用。
　　3.CKS1編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的亞基(Cyclin-dependent kinasesubunit)，參與稻瘟病菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、致病性等重要過(guò)程
　　在先前的研究中，本實(shí)驗(yàn)室鑒定了一個(gè)新的稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Som1。研究表明Som1作用于稻瘟病菌cAMP-PKA信號(hào)途徑下游，在稻瘟病菌形態(tài)分化和致病性

8、中起關(guān)鍵作用。本研究根據(jù)Δsom1的SAGE(serial analysis of geneexpression)表達(dá)譜測(cè)序數(shù)據(jù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析，選取了8個(gè)可能與Som1相關(guān)的基因進(jìn)行了敲除，其中Δcks1表型明顯與野生型菌株不同。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)CKS1的生物學(xué)功能進(jìn)行了分析，結(jié)果如下:1）酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明稻瘟病菌中Cks1與Som1之間存在互作;2）Δcks1突變體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢，菌落發(fā)白，氣生菌絲蓬松，不能產(chǎn)生分生孢子;3）qR

9、T-PCR分析顯示，色素合成基因ALB1、RSY1和BUF1，以及產(chǎn)孢相關(guān)基因COS1、CON7、ACR1、HTF1(HOX2)在Δcks1中顯著下調(diào);4）Δcks1能在菌絲尖端產(chǎn)生附著胞結(jié)構(gòu)，但附著胞功能喪失，不能穿透寄主表皮，也不能在寄主組織內(nèi)進(jìn)行侵染生長(zhǎng);5）Δcks1突變體幾乎完全喪失對(duì)大麥和水稻的致病性;6）Δcks1菌落疏水性下降，菌落呈現(xiàn)自溶現(xiàn)象;7）Δcks1突變體對(duì)細(xì)胞壁壓力脅迫抗性增加，幾丁質(zhì)合成酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平

10、在Δcks1中明顯上調(diào)，表明CKS1參與維持稻瘟病菌細(xì)胞壁完整性;8）小麥赤霉病菌的FgCKS1能恢復(fù)稻瘟病菌Δc ks1的表型缺陷，表明在絲狀病原真菌中Cks1結(jié)構(gòu)和功能都非常保守;9）Cks1-GFP融合蛋白亞細(xì)胞定位分析表明，Cks1在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，而分生孢子形成階段，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有明顯的分布;10)結(jié)構(gòu)域缺失實(shí)驗(yàn)表明Cks1蛋白中Ubiquitin-binding domain，Cdc28-binding