kibra基因啟動子表觀遺傳學修飾改變對乳腺癌浸潤和轉移影響的研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，同時也是一種具有高異質性的惡性腫瘤。常見乳腺癌包括LuminalA型乳腺癌、LuminalB型乳腺癌、Her2過表達乳腺癌和三陰性乳腺癌。原發(fā)乳腺癌一般不會引起患者死亡，浸潤和轉移是導致乳腺癌患者死亡的直接原因。已有的研究顯示上皮間質轉換（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是造成惡性腫瘤浸潤、轉移和耐藥的起始步驟。KIBRA蛋白，(kidney and brai

2、n protein)主要在腎和腦中表達的一類蛋白，定位在細胞質中，也被稱為WWC1，在Hippo-Yap信號通路中扮演至關重要的角色，主要參與記憶的形成。近年有研究表明，KIBRA可以干擾永生化乳腺癌細胞的遷移和運動，抑制乳腺癌細胞的EMT。本實驗室前期結果也發(fā)現(xiàn)，Notch3可以通過影響Kibra調節(jié)的Hippo-Yap信號通路抑制乳腺癌EMT。也有文獻報道，在急慢性淋巴細胞白血病中kibra基因啟動子的甲基化與患者不良預后有關。

3、r>　　本課題研究中，我們首先發(fā)現(xiàn)在惡性行為較高的乳腺癌細胞系中Kibra表達顯著降低，這一發(fā)現(xiàn)引起了我們極大的興趣，我們推測在不同乳腺癌細胞Kibra表達差異可能與其甲基化程度有關。眾所周知，甲基化修飾是表觀遺傳學的調控方式之一，基因組 DNA的甲基化修飾主要靠 DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMT）起作用，甲基化修飾的改變能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變

4、，這些變化往往會導致基因表達譜改變，尤其是啟動子區(qū)CpG島異常高的甲基化，是導致抑癌基因沉默表達的重要原因之一。但是，單純的CpG島、特別是幾個CpG位點的甲基化不足以抑制基因的表達。最新的研究顯示，多梳蛋白抑制復合物2（polycomb repressive complex2，PRC2）家族成員EZH2，一方面可以促進組蛋白H3K27的二重和三重甲基化，另一方面通過招募DNMT1并增強其促甲基化的活性，兩者共同抑制基因表達。由此可見檢

5、測腫瘤相關基因，特別是抑癌基因的CpG島甲基化狀態(tài)對于研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后及早期診斷具有重要意義。
　　本課題研究中，我們首先利用免疫印跡和熒光定量PCR的方法檢測了6種不同乳腺癌細胞系Kibra的蛋白和mRNA的表達水平；隨后利用甲基化預測軟件發(fā)現(xiàn)在kibra基因轉錄起始位點上游1000bp處存在甲基化的CpG島；其次，我們使用DNA甲基轉移酶抑制劑（RG108和5-aza-dC）競爭性抑制DNA甲基轉移酶，利用免疫印跡和

6、熒光定量PCR法檢測DNA甲基轉移酶抑制劑作用前后Kibra表達的變化；接下來我們設計并合成甲基化特異性的MSP引物，利用PCR法檢測6中不同乳腺癌細胞甲基化的狀態(tài)；隨后選取ER+的MCF-7細胞和ER-的MDA-MB-231細胞作為研究對象，設計BSP引物并利用PCR、“TA”克隆、測序和甲基化分析比較了兩種乳腺癌細胞系中甲基化的差異；我們也單獨選用ER-的MDA-MB-231細胞作為研究對象，分析了RG108處理組和DMSO對照組k

7、ibra基因甲基化的差異；為了說明DNA甲基轉移酶抑制劑作用的特異性，我們利用RG108處理聯(lián)合shRNA敲減Kibra展開實驗，利用免疫印跡法檢測聯(lián)合處理后Kibra及相關分子的蛋白表達。用CCK-8、克隆形成、劃痕實驗、Transwell、TUNEL等實驗方法分別研究Kibra高表達和低表達對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響；通過染色質免疫共沉淀（CHIP）的方法探究了kibra基因啟動子發(fā)生甲基化的分子機制；最后，我們以人體

8、乳腺癌組織樣本為研究對象，比較了三陰性乳腺癌和Luminal亞型乳腺癌組織中kibra基因甲基化的差異，利用免疫組織化學技術檢測兩種類型乳腺癌組織中Kibra的表達，并對結果進行統(tǒng)計學分析。
　　免疫印跡和熒光定量PCR結果顯示，Kibra表達隨著乳腺癌細胞惡性行為的增強而呈現(xiàn)下調趨勢。隨后我們分別使用20μM、100μM、500μM的RG108作用MDA-MB-231細胞7d，500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/

9、ml的5-aza-dC作用MDA-MB-231細胞5d，免疫印跡顯示隨著抑制劑濃度的升高，Kibra表達呈現(xiàn)劑量依賴性上調，其他相關分子也呈現(xiàn)相應的變化。甲基化特異性的MSP引物PCR擴增結果顯示在不同類型乳腺癌細胞的kibra啟動子區(qū)均存在部分甲基化，當使用100μM RG108作用細胞7d，各細胞的甲基化水平明顯下調或丟失。利用甲基化特異性的BSP測序引物分析顯示三陰性MDA-MB-231細胞kibra基因啟動子甲基化水平明顯高于L

10、uminal亞型乳腺癌細胞，RG108處理組與DMSO對照組相比，kibra基因啟動子甲基化水平明顯降低。單獨100μM RG108處理，隨著Kibra表達上調，乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，侵襲，浸潤和轉移能力減弱，凋亡增強；隨著100μM RG108處理聯(lián)合shRNA敲減Kibra，KIBRA表達下調，細胞各種功能部分被恢復，凋亡也隨之減弱。CHIP實驗結果顯示，乳腺癌細胞中kibra基因啟動子CpG島存在DNA甲基轉移酶，H

11、3K27me3、EZH2和SUZ12的結合位點，DNA甲基轉移酶調控基因組DNA甲基化，PRC2復合物調控組蛋白H3K27三甲基化，二者共同調控kibra基因甲基化，影響Kibra的表達。最后，乳腺癌組織樣本顯示了與細胞水平一致的研究結果，即在提取的16例乳腺癌組織標本的基因組DNA中，測序結果分析顯示三陰性乳腺癌組織標本kibra基因啟動子甲基化水平明顯高于Luminal亞型乳腺癌組織，P<0.0001為有統(tǒng)計學差異；免疫組織化學結果

12、也顯示，在22例乳腺癌組織標本中，Luminal亞型乳腺癌組織Kibra表達高于三陰性乳腺癌組織。Fisher精確檢驗P=0.04<0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　綜上所述，本研究得出的結論有以下三點：1）隨著乳腺癌惡性程度增加，Kibra的表達有部分下調或丟失；2）Kibra調控的Hippo-Yap信號通路可能與乳腺癌增生、浸潤、轉移和凋亡有關；3）kibra啟動子上存在基因組DNA和組蛋白甲基化修飾，基因組DNA的甲基化修飾受D