環(huán)境因素對心臟畸形胎兒影響的表觀遺傳學機制.pdf

1、心臟發(fā)育是一個高度復(fù)雜，時空協(xié)調(diào)的形態(tài)學發(fā)生過程，這個過程極易受外界環(huán)境干擾而導(dǎo)致心臟畸形的發(fā)生。80％的心臟畸形發(fā)生都有環(huán)境因素的參與。環(huán)境因素包括母親孕期外界接觸的環(huán)境，如有毒物質(zhì)的侵襲;還包括母親體內(nèi)微環(huán)境改變?nèi)缂膊顟B(tài)，母親孕期營養(yǎng)元素缺乏。另外，環(huán)境在參與塑造穩(wěn)定的發(fā)育表型的同時，留下表觀遺傳學修飾標記，這種表觀遺傳學修飾是可遺傳的，甚至在后代的發(fā)病過程中發(fā)揮一定的作用。因此我們推測胎兒心臟發(fā)育異常和表型改變與表觀遺傳學修飾改

2、變有關(guān)，我們分別選擇DNA甲基化修飾和microRNA作為我們研究心臟表觀遺傳學機制的載體，并從胎兒心臟異常發(fā)育和正常發(fā)育兩方面對表觀遺傳學修飾這個議題進行剖析。
　　本課題中表觀遺傳學機制主要涉及DNA甲基化修飾和microRNA兩方面，具體內(nèi)容包括三部分，分別為:1）胎兒心臟畸形發(fā)生過程中DNA甲基化修飾的調(diào)控機制;2）孕期飲酒對胎鼠大腦、心臟組織以及胎盤組織印記基因甲基化狀態(tài)的影響。3）胎兒心臟正常發(fā)育過程中microRNA

3、的表達譜分析。
　　第一部分 胎兒心臟畸形發(fā)生過程中DNA甲基化修飾的改變
　　目的:研究心臟畸形胎兒心臟組織整體性甲基化狀態(tài)改變，及心臟發(fā)育相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)與其表達的改變。
　　方法:共收集17例單純心臟畸形、14例復(fù)雜畸形合并心臟畸形和22例正常胎兒心臟組織進行DNA抽提后亞硫酸氫鹽處理，采用Roche NimbleGen's全基因組甲基化芯片檢測5例心臟畸形（2例單純性心臟畸形和3例非單純性心臟畸形）和4例正

4、常對照胎兒心臟，獲得心臟畸形組織整體性甲基化水平改變情況;應(yīng)用Sequenom MassARRAY EpiTYPER定量甲基化分析平臺驗證在15例單純心臟畸形、11例非單純心臟畸形與18例正常胎兒心臟組織中，10個心臟發(fā)育相關(guān)基因附近CpG位點的甲基化狀態(tài)分析:抽提7例單純性心臟畸形、7例正常胎兒心臟心臟組織總RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時抽提其蛋白，分別應(yīng)用定量real-time PCR和Westernblot檢測EGFR、SMA

5、D7、SLC19A1、NOTCH1在mRNA和蛋白水平的表達變化。
　　結(jié)果:心臟畸形胎兒心臟組織呈現(xiàn)整體性的低甲基化改變;在10個心臟發(fā)育相關(guān)基因附近甲基化位點中，心臟畸形（包括單純性和非單純性）胎兒心臟組織EGFR基因間、SMAD7基因內(nèi)、SLC19A1基因間CpG sites的甲基化水平升高，而NOTCH1基因內(nèi)CpG sites的甲基化水平降低;單純性心臟畸形組織中EGFR基因mRNA水平表達有下降趨勢，其編碼蛋白表達下降

6、，SMAD7基因mRNA水平有升高趨勢，其編碼蛋白表達升高，SLC19A1基因mRNA水平表達明顯降低(p=0.007)，蛋白表達也降低，NOTCH1基因mRNA水平表達有降低趨勢。
　　結(jié)論:心臟畸形胎兒心臟組織DNA甲基化水平的整體性降低和個別心臟發(fā)育相關(guān)基因CpG sites的甲基化水平改變及其基因表達的改變可能在心臟畸形的發(fā)生過程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。
　　第二部分 酒精暴露胎鼠心臟、大腦及胎盤組織印記基因Igf2/

7、H19甲基化差異區(qū)域甲基化狀態(tài)的分析及Igf2基因表達的改變
　　目的:研究酒精暴露對胎鼠心臟、大腦及胎盤印記基因Igf2/H19甲基化差異區(qū)域甲基化狀態(tài)和Igf2基因表達的影響。
　　方法:酒精灌胃處理孕6.5天至15.5天孕鼠，Sequenom MassARRAYEpiTYPER平臺檢測孕16.5天胎鼠心臟、大腦及胎盤組織印記基因Igf2/H19四個DMRs（差異甲基化區(qū)域differential methylation

8、 regions）甲基化狀態(tài)改變，定量RT-PCR檢測Igf2基因mRNA水平的表達。
　　結(jié)果:酒精暴露胎鼠心臟Igf2/H19印記基因DMR1的甲基化水平有改變，Igf2基因表達降低;大腦Igf2/H19印記基因DMR2的甲基化水平有改變，Igf2基因表達明顯升高;胎盤Igf2/H19印記基因H19 DMR甲基化水平有改變，Igf2基因mRNA水平表達也明顯高于對照組。
　　結(jié)論:酒精暴露影響胎鼠心臟、大腦及胎盤印記基因

9、Igf2/H19不同的DMR甲基化水平和Igf2基因的表達。
　　第三部分 胎兒正常心臟組織microRNA表達譜分析
　　目的:研究不同孕周胎兒心臟組織microRNA表達的時序性變化特點。
　　方法:收集5、7、9和23周齡正常胎兒心臟組織進行RNA抽提，應(yīng)用AffymetrixmiRNA2.0芯片檢測四個時間點microRNA的表達譜;Rlimma軟件分析隨孕周變化表達發(fā)生改變的microRNAs; cluste

10、r3.0軟件聚類分析microRNA表達的不同變化趨勢;GO(gene ontology)功能富集分析經(jīng)網(wǎng)站預(yù)測microRNAs靶基因;定量real-time PCR驗證芯片結(jié)果。
　　結(jié)果:胎兒期心臟組織microRNAs的表達呈現(xiàn)5個不同的變化趨勢，大部分microRNAs被預(yù)測靶調(diào)控心臟發(fā)育相關(guān)因子的表達，參與心臟心腔、室間隔、流出道等解剖結(jié)構(gòu)的形成，和心臟發(fā)育相關(guān)的重要信號通路調(diào)控。另有7個miRNAs在胎兒心臟組織中的