CDPK31通過與NIP11互作調(diào)控擬南芥砷吸收的分子機理的研究.pdf

1、砷污染問題在全球范圍內(nèi)普遍存在，中國也是砷污染最為嚴重的國家之一。人類工業(yè)廢水的直接排放等活動造成砷和其他重金屬元素在近海海域和土壤中積累現(xiàn)象也較為普遍。砷污染問題已經(jīng)嚴重威脅著沿海等地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境和人畜健康。砷流入人體最主要的途徑之一是通過食物鏈的傳遞。因此，闡明植物對砷的吸收轉(zhuǎn)運及代謝調(diào)控途徑的生物學(xué)機理對控制砷在食物鏈的傳遞意義重大。目前，As(Ⅲ)通道活性調(diào)節(jié)機制還缺乏詳細文獻報告。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)NIP1;1的活性調(diào)

2、節(jié)跟植物砷的耐受性密切相關(guān)。本研究以哥倫比亞背景的野生型擬南芥、耐砷突變體nip1;1和蛋白激酶缺失突變體cpk31為研究材料，酵母雙雜交實驗和雙分子熒光互補技術(shù)證明了鈣調(diào)蛋白激酶成員CDPK31與NIP1;1之間的互作。突變體cpk31和突變體nip1;1一樣也具有As(Ⅲ)耐受表型，而且突變體cpk31與nip1;1的地上部分和地下部分都比野生型擬南芥積累的砷更少。此外，我們發(fā)現(xiàn)CDPK31的組織表達模式也與NIP1;1一致，尤其是

3、在根部維管束的表達幾乎完全一樣。As(Ⅲ)脅迫下CDPK31和NIP1;1的表達都下調(diào)，因此，CDPK31和NIP1;1很可能是在同一個代謝通路中。在砷脅迫下，植物很可能通過下調(diào)CDPK31的表達來降低對NIP1;1的激活，從而減少植物對砷的吸收和砷由地下部分向地上部分的運輸。本研究主要探討Ca2+和CDPK31在砷吸收代謝中的調(diào)控作用。主要結(jié)果如下:
　　1.我們通過酵母雙雜交的篩庫實驗和酵母雙雜交點對點實驗，證明NIP1;1與

4、CDPK31的互作，雙分子熒光互補實驗結(jié)合亞細胞定位技術(shù)的結(jié)果也進一步證明了NIP1;1與CDPK31在擬南芥原生質(zhì)體的質(zhì)膜發(fā)生互作。
　　2.As(Ⅲ)處理耐砷突變體nip1;1-1，nip1;1-2和蛋白激酶CDPK31缺失突變體cpk31-1、cpk31-2和cpk31-3的表型分析實驗發(fā)現(xiàn)，pk31-1、pk31-2和cpk31-3與野生型相比均具有耐砷表型，但比nip1;1-1和nip1;1-2對砷的耐受性弱，而且雙突變

5、體cpk31-1nip1;1和nip1;1一樣對As(Ⅲ)耐受性較強。這暗示著蛋白激酶CDPK31可能正調(diào)控NIP1;1的活性。檢測10μmol·L-1As(Ⅲ)處理不同時間后的野生型擬南芥(Col-0)、nip1;1-1和cpk31-1突變體中的砷含量發(fā)現(xiàn)，cpk31-1和nip1;1-1突變體一樣在地下部分和地上部分積累的砷更少。同樣的表型和砷積累模式表明CDPK31很可能是NIP1;1的正調(diào)控因子。
　　3.GUS染色結(jié)果顯

6、示:CDPK31的表達模式與NIP1;1一致，二者都在根部的維管束中的中柱細胞表達較多，CDPK31在葉肉細胞以及氣孔的保衛(wèi)細胞上都有表達，在生殖器官花的萼片、柱頭也有表達，果莢的頂端基部也有表達。在NIP1;1表達的部位CDPK31都有表達，在花中的表達說明CDPK31可能影響砷在種子中的積累和地下部分到地上部分的長距離運輸。
　　4.實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，10μmol·L-1As(Ⅲ)處理Col-0后，NIP1;1和CDPK

7、31在根部的表達量都降低，NIP1;1在葉片中的表達量上升，而NIP1;1和CDPK31在三周大的植株中主要表達在根部，這意味著擬南芥不僅可以通過降低NIP1;1的表達量來減少As(Ⅲ)的脅迫，同時也可以通過降低CDPK31的表達來減少CDPK31對NIP1;1的激活。擬南芥可能優(yōu)先通過降低CDPK31的表達這條途徑來抵抗As(Ⅲ)的脅迫。
　　5.亞細胞定位技術(shù)分析NIP1;1表達變化:砷和鈣單獨或同時處理擬南芥時，Ca2+和A

8、s(Ⅲ)同時處理時野生型和突變體植株都比只用As(Ⅲ)處理時長勢好，As(Ⅲ)處理mCherry-nip1;1（RFP標記NIP1;1基因）擬南芥幼苗后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察時發(fā)現(xiàn)NIP1;1在擬南芥根部細胞中的表部位和表達量都發(fā)生變化，表達部位由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜和液泡膜，而且隨著鈣濃度的增加，NIP1;1在質(zhì)膜的表達先增加后降低。這表明鈣離子可能通過某種途徑減少NIP1;1的表達而減少擬南芥對砷的吸收，從而增強擬南芥對砷的耐受性。