Z0206細(xì)菌多糖的結(jié)構(gòu)分析及其對(duì)小鼠糖脂代謝的影響研究.pdf

1、本論文在課題組前期篩選、馴化得到一株耐硒高產(chǎn)多糖Enterobacter cloacaeZ0206菌株，深層發(fā)酵獲得Z0206細(xì)菌多糖，并初步探索了其免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒等生物學(xué)功能的基礎(chǔ)上，采用離子交換層析、凝膠滲透層析等現(xiàn)代分離純化技術(shù)，得到Z0206細(xì)菌多糖的主要組分;建立了高效液相色譜(HPLC)定量分析多糖中丙酮酸含量和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同步分析多糖中單糖和糖醛酸組成的方法，同時(shí)結(jié)合核磁共振波譜、光譜等技術(shù)對(duì)Z0206細(xì)菌

2、多糖主要組分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定;然后以自發(fā)性Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠為模型，研究了Z0206細(xì)菌多糖及其純化多糖對(duì)KKAy小鼠糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用，并在基因和蛋白水平上揭示了Z0206細(xì)菌多糖對(duì)糖脂代謝影響的分子機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.反相高效液相色譜(RP-HPLC)定量分析丙酮酸含量方法的建立及Z0206細(xì)菌多糖中丙酮酸單元的測(cè)定
　　 結(jié)合Sevage法和酶法脫蛋白、H2O2脫色、水透析、冷凍干燥以及柱

3、層析等方法對(duì)Z0206細(xì)菌多糖(CEPS)進(jìn)行純化后獲得其酸性多糖EPS。該多糖EPS經(jīng)高效凝膠色譜儀(HPGPC)檢測(cè)，其分子量約為110 KDa。
　　 在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用核磁共振波譜(NMR)、電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS)等技術(shù)確定了EPS結(jié)構(gòu)中含有丙酮酸單元;采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)考察不同的酸水解條件以及不同的定容體積等樣品前處理?xiàng)l件下的丙酮酸出峰情況，最終確定多糖完全

4、酸水解條件為3M三氟乙酸(TFA)、120℃下水解5h。水解液定容體積為100 mL;定容后的酸水解物經(jīng)過(guò)濾后采用RP-HPLC直接分析其中的丙酮酸，酸水解物經(jīng)C18色譜柱分離、紫外檢測(cè)器檢測(cè)（λ=215 nm）、外標(biāo)法定量。結(jié)果表明:EPS中丙酮酸含量為7.64％，該方法線性范圍0.0025～0.5 g/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r＞0.999;檢出限（3倍信噪比）達(dá)0.05 mg/L;加標(biāo)回收率為100.2％～101.6％。該方法用于分析

5、細(xì)菌多糖、黃芪多糖等多糖類(lèi)物質(zhì)的丙酮酸含量專(zhuān)屬性良好，為多糖類(lèi)物質(zhì)中丙酮酸的定量分析提供了新方法。
　　 2.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)同時(shí)測(cè)定單糖和糖醛酸含量方法的建立及Z0206細(xì)菌多糖的單糖組成和糖醛酸含量分析
　　 在采用反相高效液相色譜確定了EPS中丙酮酸含量的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)進(jìn)一步建立了GC-MS同時(shí)測(cè)定多糖中單糖和糖醛酸含量的方法，并對(duì)EPS的單糖組成和糖醛酸含量進(jìn)行了分析。將EPS的完全酸水解物進(jìn)行氮

6、氣吹干，采用乙硫醇-三氟乙酸和醋酐-吡啶體系先后對(duì)其中的單糖和葡萄糖醛酸進(jìn)行衍生;電子轟擊電離源質(zhì)譜(EI-MS)解析葡萄糖醛酸酸衍生物質(zhì)譜裂解途徑，并證實(shí)葡萄糖醛酸在該體系下得到了有效地衍生化;以木糖為內(nèi)標(biāo)，采用GC-MS定量分析該多糖酸水解物中單糖和糖醛酸衍生物發(fā)現(xiàn):該多糖糖鏈由巖藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖組成，其相對(duì)物質(zhì)的量比為1.95∶1.0∶1.13∶2.82;中性糖比例與糖醇乙酸酯化分析巖藻糖、葡萄糖和半乳糖的相對(duì)物質(zhì)

7、的量比(2.02∶1.0∶2.84)接近;糖醛酸咔唑法與該方法分析糖醛酸含量分別為15.23％和16.51％。結(jié)果表明新建立的衍生方法及GC-MS同時(shí)定量分析多糖酸水解物中單糖和糖醛酸的方法快速、方便。
　　 3.Z0206細(xì)菌多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及其重復(fù)單元的分析
　　 在分析測(cè)定了EPS的丙酮酸含量、單糖組成和糖醛酸含量的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)展了Z0206細(xì)菌多糖的確切化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定及重復(fù)單元分析的研究。EPS完全酸水解物衍生物

8、測(cè)定結(jié)果表明:該EPS由L-巖藻糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸和丙酮酸組成，其相對(duì)物質(zhì)的量近似為2∶1∶3∶1∶1。以上結(jié)果結(jié)合高碘酸氧化、Smith降解和甲基化等化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該多糖由1，4-連接的巖藻糖、1，3，4-連接的巖藻糖、1，3-連接的葡萄糖，1，3-連接的半乳糖，1，4-連接的半乳糖和1，4，6-連接的端基半乳糖組成，其中丙酮酸取代了該端基半乳糖4，6位羥基。
　　 采用Bio-Gel P2凝膠色譜柱分

9、離、電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)檢測(cè)餾分，純化多糖EPS部分酸水解產(chǎn)物，獲得一個(gè)寡糖—六糖;ESI-MS分析六糖分子量和系列寡糖可能的線性連接;結(jié)合多糖組成成分分析、單糖構(gòu)型分析、糖苷鍵的鍵型分析和核磁共振一維、二維波譜分析，推斷出該六糖結(jié)構(gòu)。并確定了多糖的結(jié)構(gòu)是以1，3-β-D-半乳糖殘基、1，4-β-D-半乳糖殘基、2個(gè)1，4-α-L-巖藻糖殘基為主鏈，并在其中的一個(gè)1，4-連接的巖藻糖殘基的O-3位有β-D-葡萄糖殘基取代，而1

10、，4-β-D-葡萄糖醛酸殘基又取代了該β-D-葡萄糖殘基O-3位羥基，同時(shí)丙酮酸取代了4，6位羥基的1，4，6-α-D-半乳糖殘基取代了1，4-β-D-葡萄糖醛糖殘基O-4位羥基。多糖以上述結(jié)構(gòu)為重復(fù)單元組成。
　　 4.Z0206細(xì)菌多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠糖脂代謝的影響研究
　　 在建立了HPLC測(cè)定多糖中丙酮酸含量，GC-MS同時(shí)測(cè)定多糖中單糖和糖醛酸含量的方法，解析了Z0206細(xì)菌多糖主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)

11、上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以自發(fā)性Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠為模型，從表觀變化、組織形態(tài)、血液生化指標(biāo)等方面探討了Z0206細(xì)菌多糖(CEPS)及其純化多糖(PEPS)對(duì)糖脂代謝的影響。試驗(yàn)分為正常對(duì)照組(C57/BL)、糖尿病模型組(Model)、Z0206細(xì)菌多糖組(CEPS)和Z0206純化多糖組(PEPS)組，多糖組以10 mg/mL分別連續(xù)灌胃42天，糖尿病模型組連續(xù)灌胃等量的去離子水。研究結(jié)果表明:與糖尿病模型組相比，在給藥后的14天、2

12、8天及42天，CEPS和PEPS均可顯著降低KKAy小鼠的體重(P＜0.05)，提高KKAy小鼠的葡萄糖耐量(P＜0.05)，并降低小鼠的空腹血糖濃度和血清胰島素水平（P＜0.05），從而抑制小鼠的肥胖、緩解胰島素抵抗和提高小鼠的糖耐受能力;組織形態(tài)觀察結(jié)果顯示:CEPS和PEPS均能通過(guò)緩解肝臟細(xì)胞和胰島細(xì)胞的腫脹、變性，減少脂滴形成和增加肝臟糖原含量，從而保護(hù)肝臟和胰腺組織結(jié)構(gòu)的完整性，并有效緩解肝臟的脂肪變性;生化指標(biāo)結(jié)果表明:C

13、EPS和PEPS均能通過(guò)提高小鼠肝臟(己)糖激酶活力(P＜0.05)，降低血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平（P＜0.05）和游離脂肪酸含量(P＜0.05)，同時(shí)降低小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量(P＜0.05)，從而增加葡萄糖在體內(nèi)的酵解，改善脂代謝紊亂和修復(fù)肝臟損傷。以上結(jié)果綜合表明兩種多糖能改善Ⅱ型糖尿病小鼠的胰島素抵抗癥狀，保護(hù)胰腺功能，增加體內(nèi)糖原合成和葡萄糖的酵解起到降血糖作用;同時(shí)能緩解肝臟損傷，減少脂肪變性，改善

14、機(jī)體脂代謝紊亂起到降血脂作用。但是，兩種多糖對(duì)于小鼠的糖脂代謝影響沒(méi)有差異。
　　 5.Z0206細(xì)菌多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠胰島素分泌及其肝臟糖脂代謝影響的作用機(jī)制研究
　　 在研究了Z0206細(xì)菌多糖對(duì)糖尿病KKAy小鼠表型、組織形態(tài)及生理生化指標(biāo)影響的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)進(jìn)一步從分子水平開(kāi)展了Z0206細(xì)菌多糖(CEPS)及其純化多糖(PEPS)對(duì)KKAy小鼠胰島功能和肝臟糖脂代謝影響的作用機(jī)制研究。試驗(yàn)重點(diǎn)分析了兩

15、種多糖CEPS和PEPS對(duì)KKAy小鼠胰腺功能相關(guān)基因，肝臟中糖代謝相關(guān)酶類(lèi)和脂肪代謝相關(guān)酶類(lèi)的基因或蛋白表達(dá)的影響。胰島功能結(jié)果表明:兩種多糖均能通過(guò)提高KKAy小鼠胰臟中沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的蛋白表達(dá)，降低線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的蛋白表達(dá)，改善KKAy小鼠胰腺β細(xì)胞功能，抑制因胰島素抵抗引起的胰島素代償分泌增加;糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖代謝結(jié)果表明:細(xì)菌多糖能顯著提高肝臟中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(Gl

16、ut2)的蛋白表達(dá)水平，增加糖酵解關(guān)鍵酶葡萄糖激酶(GK)的mRNA表達(dá)量，同時(shí)降低糖異生關(guān)鍵酶葡萄糖6磷酸酶(G6PC)的mRNA表達(dá)量，從而增加肝臟對(duì)血糖的攝取，促進(jìn)葡萄糖在肝臟的酵解并減少糖異生作用;脂肪代謝結(jié)果表明:多糖能提高肝臟中脂肪分解相關(guān)基因激素敏感性脂肪酶(HSL)、脂肪甘油三酯水解酶(ATGL)及脂肪酸β氧化限速酶CPT-1α的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)降低脂肪合成相關(guān)基因脂肪酸合成酶(FAS)的mRNA表達(dá)水平，從而促進(jìn)