Enterobacter cloacae Z0206富硒多糖的制備、結(jié)構(gòu)分析及其主要生物學(xué)功能研究.pdf

1、本研究通過對從肉靈芝上分離、純化的產(chǎn)多糖菌種進(jìn)行了耐硒馴化，得到了產(chǎn)多糖耐硒菌種Z0206，并對其進(jìn)行了鑒定；通過深層富硒發(fā)酵制備了富硒蛋白多糖；進(jìn)一步利用現(xiàn)代分離純化技術(shù)，得到富硒多糖及其主要組分，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析；通過建立環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制小鼠模型和H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化損傷模型，研究了富硒多糖的免疫調(diào)節(jié)功能和抗氧化活性及其作用機(jī)制。其主要研究結(jié)果如下：
　　 1.產(chǎn)多糖耐硒菌種的馴化和鑒定
　

2、　 通過平板劃線法和濃度梯度法對產(chǎn)多糖菌種進(jìn)行了耐硒馴化，得到產(chǎn)多糖耐硒菌種Z0206，并運(yùn)用形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析相結(jié)合的方法對其進(jìn)行了鑒定。鑒定結(jié)果表明，產(chǎn)多糖耐硒菌種Z0206屬于E.cloacae。將測序獲得的16S rDNA基因序列登錄GenBank，獲得登錄號為EU647232，并與其相似性較高的序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　 2.E.cloacae Z0206富硒多糖的制備
　　

3、 通過發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化得到E.cloacae Z0206富硒蛋白多糖的發(fā)酵條件：采用PDA加富培養(yǎng)基，接種量2％，培養(yǎng)溫度30℃，pH值7.0，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)第6h加硒，加硒濃度20μg/mL，發(fā)酵時間48h，起始葡萄糖濃度2％，第24h流加2％葡萄糖；利用優(yōu)化的發(fā)酵條件進(jìn)行深層富硒發(fā)酵，發(fā)酵液通過蒸發(fā)濃縮、離心、乙醇沉淀等制備得到了富硒蛋白多糖(SPPS)：產(chǎn)量為26.7g/L，含硒量為65.7mg/kg:進(jìn)一步經(jīng)S

4、evag結(jié)合酶法脫蛋白、H202脫色、透析等處理純化得到富硒多糖(SPS)。
　　 3.E.cloacae Z0206富硒多糖的結(jié)構(gòu)分析
　　 將純化得到的富硒多糖SPS經(jīng)離子交換柱層析(DEAE-52)和分離型凝膠柱層析(Sephadex G-100)分離純化得到兩個組分，其中組分1(SPS-1)占76％，采用液相色譜、紅外光譜、核磁共振等對SPS-1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析。結(jié)果表明，SPS-1是由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組

5、成的均一性雜多糖，摩爾比為8.530:0.061:0.706，分子量為23.9KD，分散系數(shù)為1.3；存在吡喃糖環(huán)構(gòu)型和α、β糖甙鍵構(gòu)型，并具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，具有較長的側(cè)鏈和較多的分枝，SPS-1平均粒徑為47.49nm，表面電荷為11.9mV，脫水溫度85.98℃，氣化溫度為256.57℃。
　　 4.E.cloacae Z0206富硒多糖的免疫調(diào)節(jié)功能研究
　　 本試驗(yàn)通過建立環(huán)磷酰胺所致的ICR小鼠免疫低下模型，研

6、究了細(xì)菌E.cloacae Z0206富硒多糖對免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制。結(jié)果表明，與空白對照組相比，環(huán)磷酰胺(50mg/kg.B.W)對免疫器官重、部分細(xì)胞和體液免疫指標(biāo)具有顯著的抑制作用(p<0.05)，即建模成功；與環(huán)磷酰胺作用組相比，200mg/kg和400mg/kg的富硒蛋白多糖(SPPS)，400mg/kg的富硒多糖(SPS)和多糖(PS)均顯著提高了脾臟和胸腺指數(shù)(p<0.05)，緩解環(huán)磷酰胺引起的脾臟和胸腺

7、萎縮，顯著提高了ConA和LPS誘導(dǎo)的脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖(p＜0.05)和細(xì)胞因子（IL-2、TNF-α）的mRNA水平(p＜0.05)；與環(huán)磷酰胺作用組相比，400mg/kg的SPPS和SPS預(yù)防性灌胃后，血清和細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2和TNF-α水平顯著升高(p<0.05)，400mg/kg的PS和200mg/kg的SPPS提高了血清中TNF-α水平、培養(yǎng)液中IL-2和TNF-α的水平(p<0.05);400mg/kg的SPPS、S

8、PS和PS預(yù)防組的CD4+、CD4+/CD8+和NK細(xì)胞活性均顯著高于環(huán)磷酰胺組(p<0.05)，CD8+細(xì)胞活性顯著低于環(huán)磷酰胺組(p

9、恢復(fù)到正常水平。從其作用效果來看：富硒蛋白多糖>富硒多糖>多糖。提示：富硒多糖可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫，而發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)作用；硒、蛋白和多糖三組分在發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用方面可能具有較強(qiáng)的協(xié)同作用。
　　 5.E.cloacae Z0206富硒多糖的抗氧化活性研究
　　 本試驗(yàn)通過建立H202誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞氧化損傷模型，研究了細(xì)菌E.cloacae Z0206富硒多糖對RAW264.7細(xì)胞氧化損傷的

10、保護(hù)作用及其作用機(jī)制。結(jié)果表明，與對照組相比，H202顯著降低RAW264.7細(xì)胞的存活率(p<0.05)；與H202單獨(dú)作用組相比，200μg/ml和400μg/ml的富硒蛋白多糖(SPPS)，400μg/ml的富硒多糖(SPS)和多糖(PS)顯著提高了SOD和GSH-Px活性，抑制ROS、MDA的產(chǎn)生和LDH的釋放，維持細(xì)胞線粒體膜的完整性，抑制跨膜電位的耗散、Caspase-3的活化和DNA的降解(p<0.05)；與H202單獨(dú)處

11、理組相比，不同濃度的（200μg/ml和400μg/ml）的SPPS和SPS，40μg/ml的PS顯著提高了Bcl-2基因的mRNA水平(p<0.05)，降低了Bax基因的mRNA表達(dá)水平(p<0.05)；與H202單獨(dú)處理組相比，SPPS(200μg/ml)和SPS(400μg/ml)顯著增加了Bcl-2基因的蛋白表達(dá)水平和Bcl-2/Bax(p<0.05)，降低了Bax基因的蛋白表達(dá)水平，PS(400μg/ml)顯著提高了Bcl-2

12、基因的蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)；與H202作用組相比，200μg/ml和400μg/ml的SPPS、SPS和PS均顯著提高了血紅素氧化酶(HO-1)的mRNA和蛋白表達(dá)水平。從抗氧化效果來看：富硒蛋白多糖>富硒多糖>多糖；對于SPPS，濃度過高，其抗氧化活性顯著下降，而SPS和PS則表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。提示：富硒蛋白多糖和富硒多糖可能通過清除活性氧，提高抗氧化酶活性、誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)以及抑制凋亡信號通路而對H202引起的RAW2