恩施高富硒植物碎米薺含硒多糖研究.pdf

1、湖北恩施州高山地區(qū)生長著一種高富硒植物——碎米薺(Cardamine)。該植物不僅硒含量高，而且是一種藥食兩用植物。為了開發(fā)利用碎米薺植物資源，本文以湖北恩施碎米薺干制粉末為原料，選擇含硒多糖為研究切入點，對碎米薺含硒多糖的分離純化特性進行了系統(tǒng)探討，為碎米薺植物資源的開發(fā)利用提供理論和實踐依據。主要研究結果如下： 1. 碎米薺多糖定量測定方法的評價 根據檢測方法的重現性、精密度、回收率和穩(wěn)定性等指標來評價檢測方法的可行

2、性，定量測定碎米薺多糖可以采用苯酚-硫酸比色法。同時發(fā)現，組成碎米薺多糖的單糖殘基以吡喃糖為主。 2. 碎米薺粗多糖的浸提特性 為探討碎米薺粗多糖的浸提特性，以1g碎米薺干粉為試驗材料，選擇蒸餾水為浸提劑，首先研究浸提溫度、浸提時間、浸取劑用量、提取次數和浸提液pH值等單因素對碎米薺粗多糖提取量的影響規(guī)律，然后設計四元二次通用旋轉組合試驗方案研究多因素對碎米薺粗多糖提取量的綜合影響。結果表明，浸提溫度、浸提時間、浸取劑用

3、量、提取次數和浸提液pH值等單因素對碎米薺粗多糖提取量有顯著影響；浸提溫度90℃、浸提時間3 h、浸取劑用量30 ml、提取次數5次和浸提液pH值為9是碎米薺粗多糖適宜的提取條件，粗多糖提取量達到4．76％。 3. 乙醇沉淀碎米薺粗多糖的規(guī)律 為探討乙醇沉淀碎米薺粗多糖的特點，首先考察乙醇濃度對多糖沉淀量的影響，然后研究乙醇沉淀次數對多糖沉淀量的影響。結果表明，90％(V/V)的乙醇濃度是碎米薺粗多糖的最佳沉淀濃度；用9

4、0％的乙醇對沉淀的碎米薺粗多糖經蒸餾水溶解后再沉淀一次，不但可以最大程度地將碎米薺粗多糖提取液中的多糖沉淀出來，而且沉淀的碎米薺粗多糖得到了一定程度的純化，有利于后續(xù)粗多糖分離純化過程的進行。 4. 碎米薺多糖共沉淀物的分離純化方法 乙醇在沉淀碎米薺粗多糖提取液中的多糖時，有一種未知化合物與多糖一起被沉淀，為了將多糖共沉淀物與多糖分離，首先用磷酸氫二鈉絮凝粗多糖提取液。離心后，收集沉淀，上清液加入磷酸氫二鈉絮凝共沉淀物，

5、反復上述操作到上清液加入磷酸氫二鈉無絮凝現象，合并沉淀，將沉淀用適量的蒸餾水溶解。向溶液中加入丙酮，丙酮沉淀的多糖與共沉淀物再用蒸餾水溶解，溶液用磷酸氫二鈉絮凝沉淀，離心后，沉淀經蒸餾水溶解用磷酸氫二鈉絮凝，如此反復將沉淀溶解、丙酮沉淀、磷酸氫二鈉絮凝，直到共沉淀物經硫酸-苯酚法檢測呈陰性為止。然后用大孔樹脂吸附層析對共沉淀物進行分離純化，層析條件是：一定濃度的樣品40 ml上柱，以流速1.2 ml/min進行動態(tài)吸附，再用濃度30％-

6、80％的甲醇以流速2.5 ml/min通過樹脂床進行梯度洗脫；最后用瓊脂糖(Sepharose)6B(20×400mm)凝膠過濾層析將共沉淀物進一步純化，層析條件是：上樣量3 ml，蒸餾水洗脫，控制洗脫流速為1.5 ml/min。 5. 共沉淀物純度鑒定及其結構表征 純化的共沉淀物用高效液相色譜法進行純度鑒定，用質譜法對其結構進行分析。結果表明共沉淀物為高效液相色譜純，是一種以連接有羥基的五元環(huán)和六元環(huán)烷烴為母核，母核之

7、間有羧酸酯鍵的大分子化合物。 6. 碎米薺共沉淀物的絮凝規(guī)律 為探討碎米薺共沉淀物的絮凝特性，選擇磷酸氫二鈉和氫氧化鈣為絮凝試劑，通過磷酸氫二鈉和氫氧化鈣用量、pH值等單個因素對共沉淀物絮凝量影響的研究及其上述兩個因素對共沉淀物絮凝量綜合影響的研究，發(fā)現影響共沉淀物絮凝量的因素是堿性的絮凝體系和金屬離子的存在，堿性條件對共沉淀物絮凝量的影響比金屬離子大。 7. 碎米薺粗多糖的色素共存特性 色素與碎米薺粗多

8、糖共存時，為了研究碎米薺色素在粗多糖溶液中被脫除的基本特性，以活性炭為吸附劑，在脫色溫度、脫色時間與活性炭用量等單因素試驗的基礎上，進行了三因素三水平的正交試驗。試驗結果經方差分析發(fā)現，上述單因素對碎米薺色素的脫除有顯著影響，并得到脫除碎米薺粗多糖色素的適宜條件為脫色溫度80℃，脫色時間4 h，活性炭用量0.8％。為盡量減少粗多糖被活性炭吸附造成的損失，以蒸餾水為解吸劑，選擇解吸溫度、解吸時間及解吸劑用量為試驗因素進行九水平均勻試驗，用

9、回歸分析對其試驗數據進行分析，發(fā)現碎米薺色素與多糖之間以非結合態(tài)形式共同存在粗多糖溶液中，并得出解吸粗多糖的適宜條件為解吸時間100 min，解吸溫度78℃，蒸餾水用量為活性炭的10倍，可有效解吸粗多糖，減少粗多糖的損失。 8. 碎米薺粗多糖的蛋白質共存特性 蛋白質與碎米薺粗多糖共存時，為了研究蛋白質在粗多糖溶液中被脫除的基本特性，以三氯乙酸為脫除碎米薺粗多糖溶液中蛋白質的試劑，進行了三氯乙酸濃度、脫除溫度和脫除時間等單

10、因素試驗和三氯乙酸濃度和處理時間二因素九水平均勻試驗。試驗結果經方差和回歸分析發(fā)現，溫度對蛋白質脫除沒有影響，三氯乙酸濃度和脫除時間對蛋白質脫除的影響存在顯著關系，并得到脫蛋白的適宜條件：室溫下，選擇4％的三氯乙酸濃度，脫除時間12-16h。 9. 碎米薺含硒多糖的純化方法 首先采用纖維素陰離子(DEAE-52)柱層析將中性和酸性含硒多糖分開，然后用葡聚糖G-100凝膠柱層析將中性含硒多糖和酸性含硒多糖進行純化，分別得到

11、一個中性含硒多糖組分和兩個酸性含硒多糖組分。高效液相色譜法鑒定中性含硒多糖(Se-P Ⅰ)的純度為色譜純，含量較大的酸性含硒多糖(Se-PⅡ)組分鑒定出兩個組分，其中一個組分為含硒多糖，另一個為未知組分。 10. 碎米薺含硒多糖Se-PⅠ的結構表征 采用化學法、氣相色譜、氣相色譜-質譜聯(lián)用、紅外光譜以及核磁共振等現代分析方法對純化的碎米薺含硒多糖Se-PⅠ結構進行了初步研究，研究結果表明，碎米薺含硒多糖Se-PⅠ是一種含