枸杞多糖的結(jié)構(gòu)分析及代謝組學(xué)研究.pdf

1、枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)是提取自我國藥食兩用中草藥枸杞中的重要活性成分。藥效學(xué)研究表明，LBP具有降低血糖等生物學(xué)效用。而與其藥效學(xué)相比，LBP作為一種水溶性蛋白多糖，攝入后如何被消化吸收進(jìn)入人體，在體內(nèi)代謝生成何種物質(zhì)從而發(fā)揮其功效作用等系列問題目前尚不清楚。因此，研究LBP等多糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征、吸收與代謝過程，是進(jìn)一步明確LBP等多糖功效發(fā)揮途徑的關(guān)鍵。本文在課題組前期研究的

2、基礎(chǔ)上，對LBP的化學(xué)組成及基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步探討;對其在大鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)、組織分布及排泄進(jìn)行了研究，初步闡明了LBP在大鼠體內(nèi)的吸收、分布及排泄過程;同時(shí)采用代謝組學(xué)方法研究了給予LBP后大鼠體內(nèi)代謝譜的變化，為LBP降糖作用機(jī)制研究提供新的思路，為深入研究和利用LBP等多糖類物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、臠BP的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)分析。采用溫水浸提和膜分離法提取枸杞子中的LBP成分，樣品經(jīng)Sevage法脫蛋白、

3、水透析以及冷凍干燥等處理，先后過DEAE離子交換柱和Sephadex凝膠柱層析純化后得水溶性LBP亞組分LBP3。分別采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)和PMP柱前衍生高效液相色譜法(PMP-HPLC)對LBP3進(jìn)行分子量和單糖組成分析，結(jié)果顯示LBP3的重均分子量(Mw)約為4.92 kDa;主要由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖胺和D-木糖五種單糖殘基組成，其摩爾比為5.52∶5.11∶28.06∶1∶1.70。在此

4、基礎(chǔ)上，分別采用紫外光譜(UV)、傅里葉紅外光譜（FTIR）、核磁共振波譜(NMR)以及掃描電子顯微鏡(SEM)等表征手段對LBP3的結(jié)構(gòu)和形態(tài)進(jìn)行初步探討，結(jié)果表明，LBP3為一蛋白多糖，分子結(jié)構(gòu)中含有氨基或亞氨基基團(tuán)，主要由α-D-吡喃糖殘基構(gòu)成，β-構(gòu)型含量較低。綜合上述分析，推測LBP3可能的直鏈結(jié)構(gòu)有八種。
　?、芁BP3的熒光標(biāo)記及其標(biāo)記物的穩(wěn)定性研究。LBP3屬于多糖類物質(zhì)，分子中既無發(fā)光基團(tuán)，也無發(fā)色基團(tuán)，不能直接

5、利用紫外或熒光分析法進(jìn)行檢測，質(zhì)譜法也不適合多糖的定量分析。因此，我們在前期實(shí)驗(yàn)和參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合LBP3的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對LBP3進(jìn)行異硫氰酸酯熒光素(FITC)標(biāo)記，得LBP3的熒光標(biāo)記物L(fēng)BP3-FITC。熒光光譜分析法檢測標(biāo)記后LBP3-FITC的熒光最大激發(fā)波長Ex和發(fā)射波長Em分別為495 nm和518 nm;標(biāo)記物中FTIC含量為1.3％。對LBP3-FITC進(jìn)行高效凝膠色譜分析表明，其分子量與標(biāo)記前比較未發(fā)生顯著變化。

6、以LBP3-FITC為研究對象，分別采用高效凝膠色譜法和熒光光譜分析法考查LBP3-FITC在磷酸緩沖液(PBS)，大鼠空白血漿、尿液以及酶溶液中的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，LBP3-FITC在體外PBS、大鼠血漿、尿液中經(jīng)37℃，60 r/min條件下孵育0、1、6、12、24 h后，其分子量和熒光強(qiáng)度均未發(fā)生顯著變化;LBP3-FITC在溶菌酶和α-淀粉酶溶液中經(jīng)37℃，60 r/min條件下孵育2、6、12h后取樣檢測也獲得類似的結(jié)果。表

7、明LBP3-FITC在體外PBS，大鼠血漿、尿液和酶溶液中能穩(wěn)定存在。同時(shí)，考查LBP3-FITC經(jīng)單次口服給予大鼠后在血漿、尿液和糞便中的穩(wěn)定性，結(jié)果表明大鼠口服LBP3-FITC后2h內(nèi)的血漿、6h內(nèi)的尿液和糞便中LBP3-FITC未發(fā)生顯著降解。說明大鼠口服LBP3-FITC后，主要以原型形式參與吸收和代謝。
　?、荓BP3-FITC在大鼠體內(nèi)的藥代學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)首先建立了LBP3-FITC在大鼠血漿、尿液、糞便及組織中的熒光

8、定量分析方法。結(jié)果表明，LBP3-FITC的熒光強(qiáng)度與大鼠血漿在0.2-20μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LBP3-FTIC在低、中、高（0.2、2.0、20μg/mL）三種濃度下的日內(nèi)精密度介于1.97％-7.28％之間，日間精密度介于2.62％-7.75％之間;血漿樣品經(jīng)室溫放置24 h、反復(fù)凍融3次、-20℃下凍存15天處理后穩(wěn)定性并未受到影響;LBP3-FITC在低、中、高三種濃度下組內(nèi)加樣回收率介于84.6％-104.0％

9、之間，組間回收率介于98.3％-100.2％之間。此外，LBP3-FITC在大鼠尿液、糞便和組織中的線性、精密度、穩(wěn)定性以及回收率分析均符合生物樣品體內(nèi)定量分析要求，表明本實(shí)驗(yàn)方法適用于LBP3-FITC在大鼠血漿、尿液等生物樣品中含量的測定。利用LBP3-FITC在大鼠生物樣品中的熒光定量分析方法對其在大鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明單次口服給予大鼠100、50、25 mg/kgLBP3-FITC后，LBP3-FITC的藥-時(shí)曲

10、線下面積AUC0-t分別為151.09±15.10，141.25±12.02，128.21±27.64mg/L.h; AUC(0-∞)分別為230.49±73.26，236.18±35.08，242.57±64.09 mg/L.h;最大峰濃度Cmax分別為7.44±0.72，6.56±0.51，5.27±0.44 mg/L;三種劑量下LBP3-FITC平均消除半衰期t1/2為38.41±9.55 h。表明LBP3-FITC在大鼠體內(nèi)半衰

11、期長，消除緩慢。大鼠單次口服給予LBP3-FITC后，組織分布實(shí)驗(yàn)表明，給藥后1h，LBP3-FITC能分布到大部分組織中，在小腸和胃中分布較高，另外主要分布在肝臟、腎臟、大腸、心臟等組織;給藥6h后，胃和小腸組織中LBP3-FITC濃度明顯下降，腎臟、肝臟、大腸中LBP3-FITC濃度明顯升高，表明LBP3-FITC吸收入血后主要經(jīng)腎臟隨尿液排出;給藥24 h后，大部分組織中LBP3-FITC濃度明顯降低。大鼠經(jīng)單次口服給予LBP3-

12、FITC后，大鼠尿液和糞便中LBP3-FITC的累積排泄量分別為0.094±0.036％和92.18±3.609％，說明大鼠單次灌胃給予SD大鼠LBP3-FITC后72 h內(nèi)，有相當(dāng)于給藥量92.274％的LBP3-FITC隨尿液和糞便排出體外，而且主要從糞便中排出。表明LBP3在動(dòng)物體內(nèi)吸收率不高。
　?、萀BP3在大鼠血清、尿液和肝臟中的代謝組學(xué)研究。建立了適用于血清代謝物譜研究的氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF MS)技

13、術(shù)并用于對照組（NC組）、2型糖尿病模型組（DM組）及枸杞多糖干預(yù)DM大鼠組（LBP3組）大鼠血清代謝物譜的分析。采用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別法(OPLS-DA)等模式識(shí)別方法對NC組、DM組及LBP3組大鼠血清代謝物譜進(jìn)行分類并從血清中尋找與2型糖尿病相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。所建立的方法能將三組大鼠血清代謝物譜分離，DM大鼠血清中丙氨酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸相對于NC組大鼠顯著降低。LBP3干預(yù)DM組大鼠一個(gè)月后，LBP3

14、干預(yù)組大鼠血清中丙氨酸、胸腺嘧啶核苷酸含量有所上升。血清中這兩類物質(zhì)可能與氨基酸代謝和核苷酸代謝有關(guān)，LBP3組大鼠與DM組大鼠血清中丙氨酸和胸腺嘧啶核苷酸水平的變化體現(xiàn)了體內(nèi)氨基酸和核苷酸代謝的改變。建立了適用尿液代謝物譜研究的GC-TOF MS技術(shù)并用于NC組、DM組及LBP3組大鼠尿液代謝物譜的分析。采用PCA、OPLS-DA等模式識(shí)別方法對NC組、DM組及LBP3組大鼠尿液代謝物譜進(jìn)行分類并從尿液中尋找與2型糖尿病相關(guān)的生物標(biāo)志

15、物。所建立的方法能將三組大鼠尿液代謝物譜很好區(qū)分，DM大鼠尿液中甲基丙二酸、苯甲酸、半乳糖醛酸水平明顯升高而2，3-二羥基丁酸、嘌呤核苷明顯降低。LBP3干預(yù)一個(gè)月后這些代謝物有向正?；謴?fù)的趨勢。LBP3干預(yù)組和DM組大鼠尿液中甲基丙二酸、2，3-二羥基丁酸、嘌呤核苷、苯甲酸水平的變化提示可能存在氧化應(yīng)激、氨基酸代謝、核苷酸代謝和腸道菌群的改變。建立了適用肝臟組織代謝物譜研究的GC-TOF MS技術(shù)并用于NC組、DM組及LBP3組大鼠肝

16、臟代謝物譜的分析。采用PCA、OPLS-DA等模式識(shí)別方法對NC組、DM組及LBP3組大鼠肝臟代謝物譜進(jìn)行分類并從肝臟組織中尋找與2型糖尿病相關(guān)的生物標(biāo)志物。所建立的方法能將三組大鼠肝臟代謝物譜完全分開，DM大鼠肝臟中肌醇、羥基丁酸、泛酸水平顯著降低而L-蘋果酸、3，6-脫水-D-半乳糖、花生酸等水平顯著升高，LBP3干預(yù)一個(gè)月后這些代謝物有向正?；謴?fù)的趨勢。LBP3干預(yù)組和DM組大鼠肝臟中蘋果酸、羥基丁酸、肌醇、花生酸水平的變化提示可

17、能存在三羧酸循環(huán)、胰島素敏感性和脂肪代謝的改變。
　?、裳芯勘砻鳎航?jīng)柱層析純化獲得LBP亞組分LBP3主要由五種單糖殘基組成，分子中含有氨基或亞氨基基團(tuán)，初級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-D-吡喃糖殘基構(gòu)成，β-構(gòu)型含量較低；利用LBP3與FITC之間的共價(jià)偶聯(lián)作用，成功將FITC標(biāo)記在LBP3分子上，LBP3標(biāo)記前后分子量未發(fā)生明顯改變。標(biāo)記物L(fēng)BP3-FITC在動(dòng)物體內(nèi)外生物樣品中顯示出較好的穩(wěn)定性；建立的LBP3-FITC熒光定量分析方法具

18、有較高的精密度、穩(wěn)定性和回收率，適用于LBP3-FITC在大鼠血漿、尿液等生物樣品中含量的測定；大鼠單次口服給予LBP3-FITC后在動(dòng)物體內(nèi)半衰期長，消除緩慢。且給藥1、6、24 h后，隨著時(shí)間的延長，LBP3-FITC不同組織中濃度變化明顯，24 h后大部分組織中濃度顯著降低；建立了適用于糖尿病大鼠血清、尿液和肝臟組織代謝物譜研究的GC-TOF MS技術(shù)，多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)DM組大鼠血清、尿液和肝臟組織中眾多代謝物濃度與NC組相比均發(fā)