白芍總苷基于代謝組學(xué)的保肝機理及體內(nèi)代謝研究.pdf

1、白芍總苷(Total glucosides of paeony，TGP)，是從傳統(tǒng)臨床常用中藥白芍中提取的有效部位。芍藥苷(Paeoniflorin，Pae)和芍藥內(nèi)酯苷(Albiflorin，Alb)是其主要的有效成分，在白芍總苷中含量最高。研究表明TGP具有明顯的保肝、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，對急、慢性化學(xué)性和免疫性肝損傷均有防治作用，有望成為保肝良藥，但是其作用機理尚不清楚，因此有必要研究白芍總苷的保肝機理。課題組前期對白芍總苷在急性

2、CCL4肝損傷大鼠模型、免疫性肝損傷大鼠模型的藥代動力學(xué)方面進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其吸收較少，生物利用度較低。推測在體內(nèi)發(fā)揮藥效作用可能是白芍總苷代謝物，因此有必要研究白芍總苷的代謝。本研究擬基于代謝組學(xué)方法尋找四氯化碳誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠模型的標(biāo)志性差異代謝物，在此基礎(chǔ)上研究白芍總苷對其的調(diào)控作用，從而闡釋其保肝機理;擬基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，采用體內(nèi)的方法研究白芍總苷的代謝。
　　第一部分、白芍總苷基于代謝組學(xué)的保肝機理研究
　　

3、目的:利用LC-MS技術(shù)基于代謝組學(xué)思路同步并行分析四氯化碳誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠模型血漿和尿液，尋找差異性代謝物。在此基礎(chǔ)上，進一步分析白芍總苷干預(yù)后，對差異代謝物的調(diào)控，闡釋白芍總苷的保肝作用機制。
　　方法:
　　1.動物和分組
　　健康wistar大鼠40只，(♂)，體重為240～280 g。按體重隨機分為4組:正常對照組、正常動物TGP給藥組、模型對照組和模型動物TGP給藥組。正常對照組和模型對照組灌胃給予純化水

4、，給藥組分別灌胃給予TGP。給藥劑量:1.41g/kg，給藥時間:14天。
　　2.生物樣品采集模型動物末次給藥后2h，腹腔注射50％ CCl4玉米油，10ml/kg(CCL4∶玉米油=1∶1)。每組尿液大鼠代謝籠中收集尿液;每組血漿大鼠斷頭取血，分為兩份血液分別處理得血漿和血清，置-80℃保存，備用。取肝左葉10％甲醛固定常規(guī)石臘包埋，HE染色。
　　3.樣品預(yù)處理
　　血漿，利用有機溶劑對血漿進行蛋白沉淀，渦旋，離

5、心，取上清液，乙腈水3∶1定溶至1mL，離心。尿液渦旋離心，乙腈與尿液1∶1沉淀蛋白，渦旋離心，取上清液，乙腈水3∶1定溶至1mL，渦旋混勻，離心。
　　4.色譜質(zhì)譜條件利用ULTRIP LC-100和AB SCIEX Q-Triple4500 System采集數(shù)據(jù)。
　　5.數(shù)據(jù)處理
　　通過被測樣本的正、負(fù)離子檢測模式的Q-Triple4500 MS譜測定得原始數(shù)據(jù)，利用AB公司的markerview1.2.1代謝

6、組學(xué)分析軟件將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為二維數(shù)據(jù)陣。通過軟件SIMCA-P進行了多變量統(tǒng)計分析，PCA(PrincipalComponent Analysis)主成分分析、偏最小二乘判別分析PLS-DA(Partialleast-Discriminant Analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析OPLS-DA(Orthogonal Partial least-Discriminant Analysis, OPLS-DA)。結(jié)合AB公司的

7、shortcut to markerview1.2.1代謝組學(xué)分析軟件的t檢驗，分析標(biāo)志性代謝物的組間差異。
　　6.差異代謝物的鑒別通過代謝物或化合物的數(shù)據(jù)庫HMDL、Massblank查找可能的代謝物。結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律解析可能代謝物的結(jié)構(gòu)，從而推測確定可能的代謝物。
　　結(jié)果:生化檢測和病理組織學(xué)觀察結(jié)果表明造模成功，白芍總苷能防治四氯化碳誘導(dǎo)大鼠的肝損傷。通過代謝組學(xué)分析血漿中鑒定3個差異性代謝物，為丙氨酸、甘氨酸和脯

8、氨酸;尿液中9個代謝物，為丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺以及有機酸類己酸、苯乙酸、2-丙烯酸、對羥基苯乙烯酸和3，4-二羥基苯丙酸。其中甘氨酸在血和尿液中均呈下降趨勢，尿液中的苯乙酸也為下降趨勢，其余均上升。TGP給藥組與空白對照組沒有明顯差異，說明藥物本身沒有影響。模型TGP給藥組回調(diào)丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸的水平，其他差異性代謝物變化不明顯。
　　結(jié)論:基于LC-MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法，通過多變量統(tǒng)計分析能夠完全區(qū)分正

9、常對照、模型對照組和模型動物TGP給藥組樣本，表明其有明顯差異性;正常動物TGP給藥組與正常對照組區(qū)分不明顯，說明TGP藥物本身對動物的影響不明顯，不是造成正常對照、模型對照組和模型動物TGP給藥組的差異性原因。并且與傳統(tǒng)藥理學(xué)的生化檢測和病理組織結(jié)果一致。
　　通過分析正常動物和造模24小時內(nèi)動物的血漿和尿液的差異性代謝物，丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺水平異常，提示CCL4誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠模型可能造成氨基酸代謝異常。有機酸

10、類己酸、苯乙酸、2-丙烯酸、對羥基苯乙烯酸和3，4-二羥基苯丙酸與腸道菌群的密切相關(guān)，因此腸道菌群也可能發(fā)生變化。
　　首次基于代謝組學(xué)方法分析白芍總苷干預(yù)CCL4誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠模型后血漿和尿液的代謝物變化，檢測到丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸水平的回調(diào)，提示白芍總苷對CCL4誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠模型有預(yù)防性保護作用。丙氨酸和脯氨酸的回調(diào)，推測TGP的調(diào)控可能與三羧酸循環(huán)有關(guān)。甘氨酸的回調(diào)說明TGP的調(diào)控可能與消除氧自由基的谷胱甘肽的合

11、成有關(guān)。對其他差異性代謝物無明顯的調(diào)控。
　　第二部分、白芍總苷的體內(nèi)代謝研究
　　目的:本研究利用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)測定芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷單體和白芍總苷在大鼠體內(nèi)的代謝物，并比較芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在單體狀態(tài)和以白芍總苷有效部位形式給藥的代謝區(qū)別，明確白芍總苷體內(nèi)的代謝物和代謝途徑，闡釋其代謝特點。
　　方法:
　　1.動物和分組
　　健康Wistar大鼠60只，(♂)，體重為240～280 g

12、，分為4組:正常對照組、芍藥苷給藥組、芍藥內(nèi)酯苷給藥組、白芍總苷給藥組。正常對照組給予1ml/100g的水，其他給藥組給予各受試物5mg/kg。
　　2.生物樣品采集在代謝籠中收集尿液，總膽管插管采集膽汁，眼眶靜脈叢取血，肝素鈉抗凝，-80℃保存，備用。
　　3.樣品預(yù)處理
　　尿液和膽汁使用固相萃取小柱(SPE，Waters Sep-PakR Vac3cc，200mgC18 Cartridges)萃取富集。血漿在4℃

13、環(huán)境復(fù)溶，3∶1甲醇水對血漿進行蛋白沉淀，氮氣吹干，甲醇復(fù)溶。
　　4.色譜質(zhì)譜條件采用質(zhì)量虧損技術(shù)，利用AB SCIEX TripleTOFTM5600 System聯(lián)用采集數(shù)據(jù)。
　　5.數(shù)據(jù)處理
　　根據(jù)對照品和血漿、膽汁和尿液中原形藥物質(zhì)譜，總結(jié)區(qū)分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)譜裂解規(guī)律。利用代謝途徑通過Metabolit1.5.1軟件多種方法尋找代謝物。
　　結(jié)果:通過分析，在體內(nèi)芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷代謝以水解、

14、氧化和葡萄糖結(jié)合、葡醛酸結(jié)合反應(yīng)為主。芍藥苷單體給予大鼠后，在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)10個代謝物，其中4個已知代謝物:芍藥苷代謝素Ⅰ的兩個構(gòu)型、芍藥苷代謝素Ⅱ和去苯甲?；炙庈?6個未知代謝物:芍藥苷結(jié)合葡萄糖C29H38O16，氧化芍藥苷C23H28O12，脫水去苯甲?；炙庈誄16H22O9，甲基化去苯甲?；炙庈盏膬蓚€異構(gòu)體C17H26O10，甲基化去苯甲?；炙庈彰撍a(chǎn)物C17H26O9。芍藥內(nèi)酯苷單體給予大鼠后，在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)14個代謝

15、物，4個已知代謝物:芍藥苷代謝素Ⅰ的兩個構(gòu)型、芍藥苷代謝素Ⅱ和去苯甲?；炙庈?10個未知代謝物:氧化芍藥苷C23H28O12，脫水去苯甲?；炙庈誄16H22O9，甲基化去苯甲?；炙庈盏膬蓚€異構(gòu)體C17H26O10，甲基化去苯甲?；炙庈彰撍a(chǎn)物C17H26O9，芍藥苷C23H28O11，加氫芍藥內(nèi)酯苷內(nèi)酯C23H30O11，蒎烷基本結(jié)構(gòu)的甲基化代謝物C11H16O4的兩個異構(gòu)體。白芍總苷給予大鼠后，在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)17個代謝物，4個

16、已知的代謝物:芍藥苷代謝素Ⅰ的兩個構(gòu)型、芍藥苷代謝素Ⅱ和去苯甲酰基芍藥苷;13個未知代謝物:氧化芍藥苷C23H28O12，二氧化芍藥苷C23H28O13，三氧化芍藥苷C23H28O14，脫水去苯甲酰基芍藥苷C16H22O9，甲基化去苯甲酰基芍藥苷的兩個異構(gòu)體C17H26O10，甲基化去苯甲酰基芍藥苷脫水產(chǎn)物C17H26O9，芍藥苷C23H28O11，加氫芍藥內(nèi)酯苷內(nèi)酯C23H30O11，芍藥苷結(jié)合葡萄糖C29H38O16，芍藥內(nèi)酯苷結(jié)合

17、葡萄糖C29H38O16，芍藥苷結(jié)合葡醛酸C29H36O17，芍藥內(nèi)酯苷結(jié)合葡醛酸C29H36O17。
　　結(jié)論:本研究利用UFLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析了白芍總苷、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠體內(nèi)的代謝物。分析測定了芍藥苷單體在大鼠體內(nèi)的10個代謝物，新發(fā)現(xiàn)6個代謝物。分析測定了芍藥內(nèi)酯苷在大鼠體內(nèi)的14種代謝物，新發(fā)現(xiàn)10個代謝物。分析測定了白芍總苷在大鼠體內(nèi)的17個代謝物，新發(fā)現(xiàn)13個代謝物。結(jié)果提示主要發(fā)生了水解反應(yīng)