基于代謝組學(xué)的逍遙散方證相關(guān)的機(jī)理研究.pdf

1、選題依據(jù)：方證對(duì)應(yīng)研究是中醫(yī)藥學(xué)研究的核心問題、也是熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。筆者試圖以慢性束縛應(yīng)激大鼠模型(肝郁脾虛證)和逍遙散為切入點(diǎn)，運(yùn)用代謝組學(xué)的技術(shù)與方法，探索出一種研究中醫(yī)方證相應(yīng)理論的新方法、新途徑。 目的：本研究基于代謝組學(xué)的研究方法，重點(diǎn)研究基于代謝組學(xué)的慢性束縛應(yīng)激大鼠模型(肝郁脾虛證)的相關(guān)變化及逍遙散對(duì)其的作用。以NMR，生物信息學(xué)等現(xiàn)代技術(shù)，通過對(duì)血液代謝組的分析，研究慢性束縛和逍遙散干預(yù)引起的大鼠內(nèi)源性代謝物的

2、變化，獲得慢性束縛應(yīng)激(肝郁脾虛證)和逍遙散給藥前后的“代謝物指紋圖譜”；分析血液“代謝指紋圖譜”變化的原因，確定與慢性束縛應(yīng)激(肝郁脾虛證)發(fā)生和逍遙散作用機(jī)理密切相關(guān)的“代謝組學(xué)特征”和小分子標(biāo)志化合物：闡明藥物作用靶點(diǎn)及作用機(jī)理，為慢性束縛應(yīng)激(肝郁脾虛證)和逍遙散作用機(jī)理的系統(tǒng)研究提供科學(xué)依據(jù)。也試圖以逍遙散為切入點(diǎn)，運(yùn)用代謝組學(xué)的技術(shù)與方法，探索出一種研究中醫(yī)方證相應(yīng)理論的新方法、新途徑。 方法：選用實(shí)驗(yàn)用二級(jí)雄性SD

3、大鼠42只，質(zhì)量200±20g，以慢性束縛方法制作應(yīng)激大鼠模型，隨機(jī)分為：7天正常對(duì)照組(A組，n=6)、2l天正常對(duì)照組(B組，n=6)、7天模型組(C組，n=6)、21天模型組(D組，n=6)、7天逍遙散1號(hào)組(E組，n=6)、21天逍遙散1號(hào)組(F組，n=6)、21天逍遙散2號(hào)組(G組，n=6)7組。分別于第8天、第22天，麻醉心室取血。在VARIAN UNITYINOVA 600MHz超導(dǎo)傅立葉變化核磁共振波譜儀上分別調(diào)用弛豫編

4、輯脈沖序列(CPMG)、擴(kuò)散編輯脈沖序列(LED)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用預(yù)飽和方式抑制水峰，飽和時(shí)間為2s，譜寬8000Hz，采樣點(diǎn)數(shù)32k，累加次數(shù)64次，預(yù)飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。自由感應(yīng)衰減(FID)信號(hào)經(jīng)過32k點(diǎn)傅立葉變換得到一維NMR譜圖。以TSP為化學(xué)位移參考峰的位置，設(shè)為0ppm。調(diào)用VNMR軟件中的程序?qū)?'1>H譜中從4.0-0.5ppm(CPMG)以及6.0-0ppm(LED)范圍內(nèi)的譜峰，按每段為0.04ppm，

5、進(jìn)行分段積分。將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化之后，以文本文件或Excel文件貯存，用于模式識(shí)別分析。將積分值進(jìn)行中心化和定標(biāo)(centering and scaling)，用SIMCA-P 10.0軟件包(瑞典，Umetrics AB，Umea)進(jìn)行主成分分析(PEA)，必要時(shí)進(jìn)行判別分析(PLS-DA)。 結(jié)果：①A、B、C、D、E、F、G各組間進(jìn)行的PCA分析結(jié)果顯示，各樣本基本集中分布于得分圖的橢圓形(95％置信區(qū)內(nèi))的4個(gè)區(qū)域，雖然A

6、、B、C、D、E、F、G各組動(dòng)物組內(nèi)樣品存在一定的差異，表現(xiàn)為有些樣品相對(duì)離散，但各對(duì)照組間基本仍能分開，說明不同組別之間存在代謝產(chǎn)物的差異。正常組(A組、B組)與模型組(C組、D組)之間代謝產(chǎn)物有明顯的不同，說明動(dòng)物模型造?；境晒ΓＰ徒M與正常組比較，兩者存在代謝網(wǎng)路的改變。模型組(C組、D組)與治療組(E組、F組、G組)各對(duì)照組間基本能分開，說明不同組別之間代謝產(chǎn)物存在差異、代謝網(wǎng)路有所不同，給與逍遙散后可以干預(yù)代謝物或代謝途徑而

7、致代謝終產(chǎn)物的改變。②正常組與模型組組間代謝標(biāo)志物比較發(fā)現(xiàn)：A、C兩組：A組含量高于C組有乳酸(1.36、1.38、1.4、4.16、4.12)、丙氨酸(1.44)、脂類化合物(0.92、1.36)、血糖(3—4)、以及谷氨酸(2.4)、VLDL和LDL(0.87、0.9l、0.95、0.99)、HDL (0.83)、膽堿(3.23、3.27)、NAC-1(2.07)；C組含量高于A組的有NAC—1(2.08)、小分子化合物(1.12)

8、、3.44ppm未知化合物、長(zhǎng)鏈脂肪酸(1.3l、1.23、1.27、1.36、1.39)、NAC-2(2.15)以及1.59ppm處未知化合物。B、D兩組：B組含量高于D組的有LDL(0.87、0.91、1.27)、不飽和脂肪酸(4—5)、飽和脂肪酸(4—5)；D組含量高于B組的有NAC-1(2.07)、NAC-2(2.16)、飽和脂肪酸(1-3)。③模型組與治療組組間代謝標(biāo)志物比較發(fā)現(xiàn)：C、E組：C組樣本中磷脂酰膽堿(3.28)、脂

9、類化合物(0.92、0.96、1.32)、NAC-2(2.15)、NAC—l(2.08、2.11)、小分子氨基酸(1)、VLDL(0.95、1.35、1.39、1.43)、甘油三酯(3.55、3.59)以及1.63ppm 3.2和3.16ppm、3.44ppm等未知化合物含量較高；而E組中乳酸(1.4、4.16、4.2)、谷氨酸(2.44)、丙氨酸(1.52)、纈氨酸(1.08)、HDL (0.87、1.21)、不飽和脂肪酸(5.31、

10、5.35)及小分子化合物(1-2)含量較高。與同時(shí)點(diǎn)的A組比較，其乳酸(1.4、4.16、4.2)、谷氨酸(2.44)、丙氨酸(1.52)、HDL (0.87、1.21)有所恢復(fù)，并有不飽和脂肪酸(5.31、5.35)及小分子化合物(1-2)含量的提升。D、F組：D組樣本中乙酸(1.96)、乳酸(4.2、1.4、4.16)、纈氨酸(1.04)、NAC-1(2.08)、NAG-2(2.15)以及小分子化合物(1-2)、化合物(3—4)含量

11、較高；F組樣本中蘇氨酸(0.92、0.96、1.32、1.36)、丙氨酸(1.48)、谷氨酸(2.44)以及3.44ppm、VLDL和LDL(0.87、0.91、1.27、1.31、1.35、)、膽堿(3.27)以及不飽和脂肪酸(5.31、5.35)等化合物含量較高。與同時(shí)點(diǎn)的B組比較，其VLDL和LDL(0.87、0.91、1.27、1.31、1.35、)及不飽和脂肪酸(5.31、5.35)等化合物有所恢復(fù)，并有蘇氨酸(0.92、0.

12、96、1.32、1.36)、丙氨酸(1.48)、谷氨酸(2.44)、膽堿(3.27)等化合物含量的增加。并隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，其F組樣本中3.4ppm、3.8ppm、2.44ppm未知化合物、磷酯酰膽堿(3.28)、膽堿(3.27)以及LDL或HDL (0.87、0.91)含量更高。D、G組：D組樣本中血糖(3—4)、乙酸(1.96)、膽堿(3.24)、NAC-2(2.15)、NAC-1(2.08)、3.2ppm、1.48ppm等處所表示

13、的化合物含量較高、脂類化合物含量相對(duì)較低；而G組樣本中脂類化合物(0.92、0.96)、乳酸(1.36、1.4、4.16)、蘇氨酸(1.32)、甲硫氨酸(2.16)、VLDL和LDL(0.87、0.91、1.27、1.31、1.35、)、磷酯酰膽堿(3.23)以及不飽和脂肪酸(1.99、5.31、5.35)等化合物含量較高。④隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，3.4ppm、3.8ppm、2.44ppm未知化合物、磷酯酰膽堿(3.28)、膽堿(3.27)

14、以及HDL(0.87、0.91)含量更高。⑤F組(逍遙散1號(hào)組)與G組(逍遙散2號(hào)組)組間代謝標(biāo)志物比較發(fā)現(xiàn)： F、G兩組樣本中成分類似。相對(duì)而言，G組中各化合物含量比F組要高，G組樣本中VLDL和LDL(0.87、0.9l、1.27、1.31、1.35)、膽堿(3.23)、不飽和脂肪酸(1.99、5.31、5.35)、乳酸(1.4、1.36、4.16)、丙氨酸(1.52)、蘇氨酸(1.32)、脂類化合物(0.92、0.96)等化合物含

15、量較高；F組樣本中血糖(3-4)、谷氨酸(2.44)、NAC-1(2.08、2.12)、2.12ppm化合物含量較高。 結(jié)論：①代謝組學(xué)方法是研究中醫(yī)癥候和中醫(yī)方證相關(guān)機(jī)理的良好平臺(tái)。②從代謝組學(xué)的角度來看，慢性束縛應(yīng)激大鼠模型與中醫(yī)肝郁脾虛證存在對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)性。③慢性束縛應(yīng)激大鼠(肝郁脾虛證)代謝表型為乳酸、膽堿、NAC、飽和脂肪酸、血糖上升降，不飽和脂肪酸、HDL、3.44ppm等化合物含量降低。其代謝產(chǎn)物標(biāo)志物可能是乳酸、膽堿

16、、NAC、飽和脂肪酸、血糖、不飽和脂肪酸、HDL、3.44ppm等化合物。④慢性束縛應(yīng)激(肝郁脾虛證)發(fā)生的代謝終產(chǎn)物的改變以脂類物質(zhì)更明顯，其具體發(fā)生的代謝物、代謝終產(chǎn)物或代謝途徑的改變還需進(jìn)一步研究。⑤逍遙散的作用顯示出多途徑、多靶點(diǎn)、雙向調(diào)節(jié)特點(diǎn)。從代謝組學(xué)角度看，逍遙散可使代謝終產(chǎn)物乳酸、膽堿、NAC、飽和脂肪酸、血糖下降，不飽和脂肪酸、HDL、3.44ppm等化合物含量升高，表現(xiàn)為明顯的代謝終產(chǎn)物的調(diào)節(jié)效應(yīng)。其作用的靶點(diǎn)包含肝