基于PPARγ-ANGPTL4探討白芍總苷改善阿霉素腎病的作用機(jī)理研究.pdf

1、目的：
　　腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)是一種常見的腎臟疾病，其主要臨床特征是蛋白尿，低白蛋白血癥，高脂血癥和全身性的水腫。腎病綜合征發(fā)生的直接原因是免疫等各種因素導(dǎo)致的腎小球?yàn)V過屏障的受損。足細(xì)胞及其裂孔隔膜是腎小球?yàn)V過屏障的最后一層，其在腎小球?yàn)V過功能中發(fā)揮舉足輕重的作用。血管生成素樣蛋白4(Angiopoietin-like Protein4)是一種新發(fā)現(xiàn)的分泌型蛋白，在腎病綜合征中，足細(xì)胞分泌的

2、ANGPTL4過表達(dá)可造成足細(xì)胞損傷，進(jìn)而產(chǎn)生大量蛋白尿，影響腎病綜合征的發(fā)生和發(fā)展。目前知道ANGPTL4是過氧化物增殖酶受體γ(peroxisomeproliferater-activated receptorγ，PPARγ)的靶基因。PPARγ/ANGPTL4調(diào)控作用與NS的發(fā)病機(jī)制可能具有密切相關(guān)性。白芍總苷（Total glucosides of paeony，TGP）是中藥白芍干燥根的提取物，TGP具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的藥理作

3、用。研究表明，TGP對腎病綜合征中的腎臟損害有一定的治療作用，并可以緩解腎病中蛋白尿的發(fā)生發(fā)展。但其藥理作用和機(jī)制有待進(jìn)一步的闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)通過一次性尾靜脈注射阿霉素(adriamycin，ADR)建立NS模型，觀察TGP對NS的治療作用;在體外培養(yǎng)足細(xì)胞，觀察白芍總苷對阿霉素刺激的足細(xì)胞的保護(hù)作用。并深入探討TGP治療NS的治療作用是否與TGP對PPARγ/ANGPTL4的調(diào)控有關(guān)。
　　方法:
　　1、TGP對NS大

4、鼠的治療作用及對PPARγ/ANGPTL4的調(diào)控作用
　　取SD大鼠50只，10只作為空白對照，另外40只按照文獻(xiàn)方法，一次性尾靜脈注射阿霉素，建立阿霉素腎病動物模型。將造模動物分為模型組、白芍高、低劑量組、他克莫司組。自造模第二周起，藥物進(jìn)行灌胃治療，連續(xù)灌胃6周。
　?、僖源笫竽虻鞍?，血清生化指標(biāo):血肌酐、尿素氮、總蛋白、白蛋白、甘油三酯、總膽固醇，和腎臟病理形態(tài)學(xué)評價白芍總苷對腎病綜合征的治療作用。以透射電鏡觀察腎組織

5、足細(xì)胞的形態(tài)，免疫組化檢測腎組織內(nèi)desmin和synaptopodin的表達(dá)評價白芍總苷對阿霉素腎病綜合征足細(xì)胞的保護(hù)作用。
　?、谑褂肦T-PCR技術(shù)檢測腎組織內(nèi)PPARγ及ANGPTL4 mRNA的變化，使用Westeren Blot技術(shù)檢測腎組織內(nèi)PPARγ及ANGPTL4蛋白的表達(dá)。
　　2、TGP對足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及對PPARγ/ANGPTL4的調(diào)控作用
　　體外培養(yǎng)小鼠永生化的足細(xì)胞，將分化成熟的足細(xì)

6、胞分為空白對照組:空白的培養(yǎng)基組;ADR組:0.1μmoL/L的ADR，24h; TGP組:0.1μmoL/L ADR+100μg/mL TGP，24h; GW9662組:0.1μmoL/L ADR+1μmoL/LGW9662,TGP加GW9662組:100μg/mLTGP+0.1μmoL/L ADR+1μmoL/LGW9662。
　?、僖訫TT檢測細(xì)胞活力，AnexinⅤ/FITC試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，免疫熒光觀察足細(xì)胞損傷因子d

7、esmin、正常足細(xì)胞標(biāo)志分子synaptopodin的表達(dá)。
　?、谝訵esteren Blot檢測足細(xì)胞上ANGPTL4以及PPARγ的表達(dá)，評價白芍總苷是否通過PPARγ抑制ANGPTL4的表達(dá)改善阿霉素所致的足細(xì)胞損傷。
　　結(jié)果:
　　1、TGP對NS大鼠的治療作用及對PPARγ/ANGPTL4的調(diào)控作用
　?、倥c模型組比較，白芍總苷可以改善大鼠的精神狀態(tài)，提高大鼠的體重，降低24h尿蛋白;降低血肌酐和

8、尿素氮，提高血清總蛋白和白蛋白含量，降低甘油三酯和膽固醇含量，改善腎功能及降低血清脂質(zhì)水平。白芍總苷還可以改善腎臟病理病變，保護(hù)足細(xì)胞的數(shù)目和功能，提高足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin的表達(dá)，降低足細(xì)胞損傷蛋白desmin的表達(dá)。
　?、赗T-PCR及Westeren Blot結(jié)果表明，模型組的PPARγ表達(dá)降低，而ANGPTL4的表達(dá)升高。白芍總苷可以提高阿霉素腎病模型中的PPARγ的表達(dá)，減少阿霉素腎病模型中ANGPTL

9、4的表達(dá)。
　　2、TGP對足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及對PPARγ/ANGPTL4的調(diào)控作用
　?、袤w外實(shí)驗(yàn)表明，TGP對培養(yǎng)的足細(xì)胞具有保護(hù)作用。MTT結(jié)果表明，TGP可以顯著提高足細(xì)胞的活力，AnexinⅤ/FITC凋亡實(shí)驗(yàn)表明，TGP可以減少阿霉素引起的足細(xì)胞凋亡。并且，TGP可以明顯減少阿霉素引起足細(xì)胞損傷蛋白desmin的高表達(dá)，提高足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin的表達(dá)。而PPARγ的抑制劑GW9662加入后可

10、以降低足細(xì)胞的活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少synaptopodin的表達(dá)，提高desmin的表達(dá)。當(dāng)PPARγ被抑制后，TGP不能提高足細(xì)胞的活力，也不能減少足細(xì)胞的凋亡，并且不能提高synaptopodin的表達(dá)，和減少desmin的表達(dá)。
　　②體外Westeren Blot實(shí)驗(yàn)表明，與阿霉素組比較，TGP可以提高足細(xì)胞PPARγ的表達(dá)，降低ANGPTL4的表達(dá);阿霉素組比較，GW9662組的PPARγ的表達(dá)顯著降低，ANGPTL

11、4的表達(dá)顯著升高;與GW9662比較，白芍總苷+GW9662+阿霉素組的PPARγ和ANGPTL4的表達(dá)沒有差異。
　　結(jié)論:
　　1、TGP對NS模型大鼠具有良好的治療作用，能夠顯著降低蛋白尿水平，提高大鼠血清蛋白水平和降低大鼠血清脂質(zhì)水平，改善腎功能指標(biāo)，改善NS大鼠的腎臟病理損傷，保護(hù)足細(xì)胞，從而延緩NS的進(jìn)展。其機(jī)制可能是TGP可以上調(diào)PPARγ的表達(dá)，且下調(diào)ANGPTL4的表達(dá)。
　　2、TGP對體外培養(yǎng)的N