姜黃素對小鼠阿霉素腎病作用的實驗研究.pdf

1、阿霉素(adriamycin，ADR)誘導的腎病被認為與人類的微小病變及局灶階段性腎小球硬化(focalsegmentalglomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)及其相似。盡管阿霉素誘導的大鼠腎病模型已廣泛應(yīng)用于實驗研究，但此模型在小鼠中成功的建立國內(nèi)還沒有見到報道。國外曾有報道阿霉素腎病小鼠有其獨特的優(yōu)越性，如成模時間快、經(jīng)濟易操作、更有益于遺傳學和免疫學研究等。ADR誘導的腎臟病理改變的機制目前還不清楚，雖然與對上皮細胞的直

2、接毒性效應(yīng)有關(guān)，但不可能是因為阿霉素毒性的慢性累積效應(yīng)造成的進展性腎小球和腎間質(zhì)的損傷，因為阿霉素能夠迅速的被血液和腎臟清除掉。本課題擬建立小鼠阿霉素腎病模型，進一步探討其發(fā)病機制。 NF-κB是一種介導細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的重要因子，一般情況下NF-κB是以P50-P65IκB結(jié)合成三聚體以無活性的形式存在于細胞漿中。目前已發(fā)現(xiàn)它調(diào)節(jié)著100多種靶基因的表達，如細胞因子、化學趨化因子、生長因子、粘附分子等，多數(shù)均參與宿主的免疫和炎癥

3、反應(yīng)。這些因子對于免疫細胞的趨化、浸潤、活化、增生、分泌等有直接的調(diào)節(jié)作用。IκB是細胞內(nèi)NF-κB的主要抑制因子，細胞內(nèi)IκB的水平、IκB受信號刺激后能否正常磷酸化進而降解對NF-κB活化起關(guān)鍵作用。在許多實驗性腎小球腎炎如抗腎小球基底膜腎炎、系膜增殖性腎小球腎炎、免疫復合物性腎小球腎炎等模型中均可見腎小球或腎皮質(zhì)中NF-κB活性的增加。但NF-κB活化在阿霉素腎病中的作用研究報道的較少。 姜黃素作為一個傳統(tǒng)的藥物已被廣泛用

4、于臨床治療，如類風濕性關(guān)節(jié)炎、腸炎性疾病、動脈硬化、皮膚損傷、肝膽疾病等。目前姜黃素在治療腎臟疾病中已引起廣泛的重視。姜黃素能降低腎缺血再灌注和單側(cè)輸尿管阻塞模型大鼠血肌酐水平，抑制腎組織中RANTES、MCP-1，和同種移植物炎癥因子mRNA表達，從而減輕腎小管損傷及其間質(zhì)炎癥反應(yīng)，此外，姜黃素能延長皮膚移植物的存活時間，還可減少阿霉素腎病尿液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖酸苷酶、纖維連接蛋白、氨基葡糖多聚糖的含量，提示姜黃素具有潛在

5、的免疫抑制及腎臟保護作用。 本課題通過成功建立小鼠阿霉素腎病模型及體外培養(yǎng)細胞，動態(tài)觀察了NF-κB/IκB信號通路及受其調(diào)控的某些因子(本實驗只研究了MCP-1)及免疫炎性細胞的變化在阿霉素腎病發(fā)病中的作用以及姜黃素對阿霉素腎病的作用及機制，旨在進一步為姜黃素在腎臟疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用提供有力的實驗依據(jù)。 第一部分小鼠阿霉素腎病的實驗研究 目的:為了更好的研究阿霉素腎病的發(fā)病機理，尋求建立一個穩(wěn)定性好、個體差異小與

6、人類腎病極其相似的動物模型。 方法:給予Balb/c小鼠尾靜脈注射阿霉素10.5mg/kg后觀察0、1、2、4、6、8周體重、尿蛋白、血清白蛋白、血甘油三酯、膽固醇、腎功能、外周血淋巴細胞及病理學改變以及腎組織中NF-κB活化、MCP-1的表達以及免疫炎性細胞的浸潤變化情況。 結(jié)果:小鼠慢性進展性腎病模型復制成功。尿蛋白、血甘油三酯、膽固醇等隨著實驗的進程明顯增高，而血清白蛋白、腎功能進行性下降，腎臟病理由微小病變型發(fā)展

7、至腎小球硬化型，NF-κB異?；罨CP-1表達增多，CD4+、CD8+T細胞逐漸增多、巨噬細胞逐漸減少。結(jié)論本實驗成功的建立了一個穩(wěn)定性好、重復性好、個體差異小且與人類慢性腎病極其相似的小鼠阿霉素腎病模型，NF-κB異?；罨赡茉诎⒚顾啬I病發(fā)病機制中起著重要的作用。 第二部分姜黃素對小鼠阿霉素腎病作用的實驗研究 實驗一姜黃素調(diào)節(jié)小鼠免疫功能的實驗研究 目的:探討姜黃素對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用及其可能

8、機制。 方法:通過噻唑藍(MTT)比色法研究姜黃素對小鼠脾淋巴細胞增殖及小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能的影響；用WesternBlot法檢測脾淋巴細胞胞核NF-κBp65蛋白的表達。 結(jié)果:姜黃素能夠增加小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能；小劑量姜黃素能夠增加小鼠脾淋巴細胞的增殖；大劑量姜黃素能夠抑制小鼠脾淋巴細胞的增殖；姜黃素能夠抑制脾淋巴細胞胞核NF-κBp65蛋白的表達。 結(jié)論:姜黃素具有調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用，且與劑

9、量相關(guān)；可能的機制與抑制NF-κB活性有關(guān)。 實驗二姜黃素對阿霉素腎病小鼠脾淋巴細胞誘導系膜細胞增殖及MCP-1表達的作用及其機制 目的:探討姜黃素對阿霉素腎病小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液誘導系膜細胞增殖及MCP-1基因與蛋白表達的作用及其可能的機制。 方法:通過噻唑藍(MTT)比色法研究姜黃素對阿霉素腎病小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液刺激大鼠腎小球系膜細胞增生的影響；用RT-PCR、ELISA、Westernb

10、lot的方法檢測系膜細胞MCP-1mRNA的表達及其蛋白的分泌以及NF-κBP65的核轉(zhuǎn)位。 結(jié)果:姜黃素能夠抑制阿霉素腎病小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液刺激大鼠腎小球系膜細胞增生及NF-κBP65的核轉(zhuǎn)位，從而減少系膜細胞MCP-1mRNA的表達及其蛋白的分泌。 結(jié)論:姜黃素抑制阿霉素腎病小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液刺激大鼠腎小球系膜細胞增生，其機制可能與抑制NF-κB/IκB信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。 實驗三姜黃素對

11、小鼠阿霉素腎病作用的實驗研究 目的:探討姜黃素對小鼠阿霉素腎病的作用及其可能的作用機制。 方法:給予Balb/c小鼠尾靜脈注射阿霉素10.5mg/kg，1w后給予姜黃素灌胃，分別于注射阿霉素后1w、2w、4w、6w、8w動態(tài)觀察及用RT-PCR、IHC、Westernblot方法檢測MCP-1、NF-κB、IκBα、IκBβ、免疫細胞等的表達。 結(jié)果:小鼠腎組織呈慢性進展性損傷，腎組織中NF-κB活性顯著增強，M