姜黃素對(duì)腸黏膜屏障保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的： 腸黏膜屏障功能是指正常腸道具有較為完善的功能隔離帶，可防止致病性病原體及毒素的侵入。在嚴(yán)重創(chuàng)傷、大面積燒傷、出血性休克、手術(shù)、放化療、長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗生素或免疫抑制劑、營(yíng)養(yǎng)不良、重癥胰腺炎等應(yīng)激狀態(tài)下或長(zhǎng)期進(jìn)行腸外營(yíng)養(yǎng)的情況下，腸道的結(jié)構(gòu)和功能可能受到嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致腸道屏障功能障礙，進(jìn)而引起腸道細(xì)菌易位，甚至誘發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)，進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能衰竭(MODS)而危及生命。如何及時(shí)正確評(píng)估腸道屏障功能

2、對(duì)于判斷患者的病情、估計(jì)其預(yù)后、并及時(shí)給予綜合治療具有非常重要的意義。但目前直接觀察腸道屏障功能仍較困難，多通過(guò)間接的方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 材料與方法： 一、姜黃素對(duì)大鼠腸黏膜的保護(hù)作用及機(jī)制的研究 采用腹腔內(nèi)注射氨甲蝶呤(MTX)的方法制備SD大鼠小腸炎模型。將60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(腹腔內(nèi)注射生理鹽水)、模型組(MTX，20mg/kg)、姜黃素組(curcumin100mg/kg)和N-乙酰半胱氨酸組(NAC

3、，150mg/kg)，制模當(dāng)天開(kāi)始，每日按劑量灌胃一次，正常對(duì)照組和模型組灌生理鹽水。制模過(guò)程中每天觀察大鼠腹瀉和肉眼血便情況，在實(shí)驗(yàn)第6d處死大鼠，取部分腸段置于多聚甲醛內(nèi)固定、包埋、切片、HE染色，行一般組織病理學(xué)觀察，30～50mg腸黏膜提取RNA、腸上皮細(xì)胞胞漿蛋白。 1，觀察大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)和小腸黏膜損傷指數(shù)(CMDD，光鏡下組織學(xué)評(píng)分(HS)。 2，分光光度法檢測(cè)血漿D-乳酸和DAO水平。

4、3，生化法檢測(cè)大鼠小腸組織MPO和SOD活性。 4，運(yùn)用ELISA測(cè)定大鼠血漿IL-10水平。 5，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)大鼠腸上皮細(xì)胞內(nèi)致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。 6，Westernblot分析胞質(zhì)內(nèi)IκB的降解、p38、ERK、JNK蛋白表達(dá)。 二、姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的保護(hù)作用及機(jī)制 應(yīng)用大鼠腸上皮細(xì)胞株IEC-6細(xì)胞，以

5、脂多糖作為刺激因素，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、脂多糖(LPS)組、姜黃素(curcuminpretreat，20μmol/l)預(yù)孵組、p38抑制劑SB203580預(yù)孵組(SBpretreat，20gmol/l)。正常對(duì)照組不加任何處理因素，其它3組均加入LPS，濃度為100ng/ml。姜黃素預(yù)孵組和p38抑制劑SB203580預(yù)孵組在加入LPS前60min分別加入濃度為20μmmol/l的姜黃素和SB203580。孵育30m

6、in后終止。 1，運(yùn)用ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液IL-10水平。 2，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)IEC-6細(xì)胞TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。 3，應(yīng)用NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NF-κB(p65)在細(xì)胞核內(nèi)的分布。 4，Westernblot分析胞質(zhì)內(nèi)IκB的降解和MKP-1蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 一、姜黃素對(duì)大鼠腸黏膜的保護(hù)作用及機(jī)制的研究 1、

7、姜黃素對(duì)大鼠糞便性狀和腸黏膜組織學(xué)的影響MTX組在腹腔內(nèi)注射氨甲蝶呤后，第2d即出現(xiàn)腹瀉，第3d部分出現(xiàn)肉眼血便，第6d全部出現(xiàn)肉眼血便。curcumin治療組與NAC組癥狀無(wú)明顯差別，于第3d開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉、解黃色稀便等現(xiàn)象，但未出現(xiàn)血便，第6d也部分出現(xiàn)肉眼血便。組織切片觀察發(fā)現(xiàn)：MTX組見(jiàn)黏膜及黏膜下層血管高度擴(kuò)張充血，腸隱窩形態(tài)的喪失、絨毛萎縮、脫落，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，呈典型炎癥改變；curcumin治療組與NAC組治療組炎癥明顯

8、減輕，腸隱窩形態(tài)喪失、絨毛萎縮、脫落現(xiàn)象較模型組明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少。正常對(duì)照組無(wú)改變。以上結(jié)果說(shuō)明：姜黃素對(duì)SD大鼠小腸炎有明顯的治療作用，對(duì)腸黏膜有保護(hù)作用，能夠防止炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減弱炎癥反應(yīng)，減輕腸炎癥狀。 2、姜黃素對(duì)腸黏膜MPO、SOD活性的影響模型組腸黏膜SOD、MPO活性分別明顯高于正常組(P=0.000)，姜黃素組和NAC組均可下調(diào)MPO活性，增強(qiáng)SOD活性。而且姜黃素可明顯增強(qiáng)大鼠腸黏膜組織SOD表達(dá)，降低

9、腸黏膜組織MPO活性。說(shuō)明姜黃素具有抗氧化作用，同時(shí)可減輕炎細(xì)胞的浸潤(rùn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠小腸炎具有保護(hù)作用。 3、姜黃素可改善腸黏膜通透性分光光度法檢測(cè)血漿D-乳酸和DAO水平。結(jié)果顯示：與正常組相比，MTX組D-乳酸和DAO水平明顯升高(P=0.000)。curcumin組與NAC治療組D-乳酸、DAO較MTX組有明顯下降(P=0.000)。由此可見(jiàn)，姜黃素可以改善腸黏膜的通透性，對(duì)大鼠腸黏膜屏障具有保護(hù)作用。 4、姜黃素

10、對(duì)大鼠腸上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-10及ICAM-1表達(dá)的影響運(yùn)用ELISA測(cè)定大鼠血漿IL-10水平，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)大鼠腸上皮細(xì)胞內(nèi)致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：MTX組TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平均較正常對(duì)照組明顯增高，Curcumin組與NAC治療組TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平低于MTX組。

11、但I(xiàn)L-10的表達(dá)高于MTX組(p=0.000)，curcumin治療組與NAC組治療組之間差距無(wú)顯著性(P=0.43)。上述結(jié)果表明：姜黃素對(duì)TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表達(dá)有明顯抑制作用，對(duì)IL-10的表達(dá)有增強(qiáng)的作用。 5、姜黃素對(duì)大鼠腸上皮細(xì)胞內(nèi)IκB、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響實(shí)驗(yàn)顯示MTX組胞質(zhì)中IκB明顯降解。但姜黃素和NAC組的IκB的降解較MTX組明顯減少。MTX組磷酸化p38明顯增加，均較正

12、常對(duì)照組明顯增高(p=0.000)，但磷酸化的JNK1/JNK2和ERK1/ERK2蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。結(jié)果表明：在MTX誘導(dǎo)的大鼠小腸炎腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中，磷酸化p38增加，姜黃素對(duì)磷酸化p38有明顯的抑制作用(p=0.000)。 二、姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的保護(hù)作用及機(jī)制 1、姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞MKP-1、IκB、p65的作用LPS組磷酸化的MKP-1水平均較正常對(duì)照組明顯增高(p

13、=0.000)，姜黃素和SB預(yù)孵組明顯高于LPS組。LPS組胞質(zhì)中IκB較正常對(duì)照組明顯降解(p=0.000)，但姜黃素和SB預(yù)孵組的IκB明顯高于MTX組(p=0.000)。應(yīng)用NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)試劑盒NF-κB(p65)在細(xì)胞核內(nèi)的分布，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：LPS組p65的核轉(zhuǎn)運(yùn)明顯，核內(nèi)紅色熒光明顯強(qiáng)于對(duì)照組，姜黃素和SB預(yù)孵組的紅色熒光強(qiáng)于對(duì)照組，但弱于LPS組，說(shuō)明LPS刺激的情況下，p65和IκB解聚，其核定位

14、序列被暴露，從而被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)。但姜黃素能抑制p65的核轉(zhuǎn)運(yùn)。 2、姜黃素對(duì)IEC-6細(xì)胞內(nèi)致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β，抑炎因子IL-10和ICAM-1mRNA表達(dá)的影響LPS組TNF-α、IL-1β、ICAM-1的表達(dá)水平均較正常對(duì)照組明顯增高，IL-10明顯減少。但姜黃素和SB預(yù)孵組的表達(dá)較LPS組表達(dá)明顯減少，IL-10明顯增高。上述結(jié)果表明：姜黃素對(duì)TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表達(dá)有明顯抑制作

15、用，對(duì)IL-10表達(dá)有明顯上調(diào)作用。 結(jié)論： 一、姜黃素對(duì)MTX誘導(dǎo)的大鼠小腸炎腸黏膜的通透性有保護(hù)作用。姜黃素具有抗氧化作用，同時(shí)可減輕炎細(xì)胞的浸潤(rùn)。 二、姜黃素能夠減少M(fèi)TX誘導(dǎo)的大鼠小腸炎與LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)模型的TNF-α、IL-1β、ICAM-1mRNA的表達(dá)，增強(qiáng)IL-10mRNA的表達(dá)。 三、姜黃素對(duì)MTX致大鼠小腸炎模型的腸黏膜上皮NF-κB和p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有抑制作用，