蓖麻堿肝毒性代謝組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　 本研究采用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用(Ultra-performance liquidchromatography-mass spectrometry，UPLC-MS)技術(shù)，血清生化指標(biāo)和組織病理學(xué)為基礎(chǔ)，進(jìn)行給予蓖麻堿后大鼠血清和尿液中的內(nèi)源性代謝物變化的研究，結(jié)合模式識(shí)別方法進(jìn)行分類并尋找標(biāo)記物，解釋內(nèi)源性代謝物的可能代謝途徑，探討蓖麻堿肝毒性的本質(zhì)。
　　 方法：
　　 健康Wistar大鼠口服灌胃

2、蓖麻堿連續(xù)灌胃14天，每天兩次，采用血清生化指標(biāo)和組織病理切片確定蓖麻堿致肝毒性結(jié)果;采用UPLC-MS方法測(cè)定大鼠血清和尿液樣本。尿液樣品色譜分析條件:色譜柱為ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(2.1mm×100 mm I.D，1.7μm，美國(guó)Waters公司)，流速為0.25 mL/min，柱溫為40℃，樣品室溫度為4℃，流動(dòng)相A相為水（含0.1％甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（含0.1％甲酸），梯度洗脫(0 min:A為95

3、％，B為5％;2 min:A為95％，B為5％;10 min:A為70％，B為30％;12.5 min:A為5％，B為95％;13.5 min:A為5％，B為95％;16min:A為95％，B為5％）。尿液樣品質(zhì)譜分析條件:采用電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子兩種模式同時(shí)檢測(cè)，全掃描(Full scan)方式，毛細(xì)管電壓為3000V（正離子），2800V（負(fù)離子），錐孔電壓為25V，離子源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度為300℃，脫溶劑

4、氣流量為400 L/h，錐孔氣流量為30 L/h，掃描范圍為質(zhì)荷比m/z110-1000。血清樣品色譜分析條件:梯度洗脫程序?yàn)?0 min:A為100％，B為0％;0.5 min:A為100％，B為0％;20 min:A為5％，B為95％;21 min:A為5％，B為95％），此外均與尿液樣品的分析條件相同。血清樣品質(zhì)譜分析條件:錐孔電壓為35V;脫溶劑氣溫度為350℃，此外均與尿液樣品的分析條件相同。
　　 采用系統(tǒng)配置的Ma

5、rkerlynx軟件(version4.0，Warters Ltd，USA)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行色譜峰的識(shí)別、自動(dòng)峰匹配、峰對(duì)齊和峰面積歸一化等處理。采用主成分分析方法(PCA)模式識(shí)別方法對(duì)代謝物譜進(jìn)行分類并從中尋找與蓖麻堿肝毒性相關(guān)的生物標(biāo)志物。通過(guò)正一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜掃描，結(jié)合文獻(xiàn)、在線數(shù)據(jù)庫(kù)等方法鑒定生物標(biāo)記物。
　　 結(jié)果：
　　 生化指標(biāo)和組織病理學(xué)切片結(jié)果表明高劑量60mg·kg-1灌胃給予大鼠蓖麻堿致肝毒性的結(jié)果最

6、明顯。經(jīng)主成分分析后所得的score圖可以看出給藥后大鼠的樣本逐漸遠(yuǎn)離對(duì)照組即不給藥的樣本，從代謝組學(xué)角度上可以觀測(cè)到大鼠服用蓖麻堿過(guò)程隨著給藥劑量的增高呈現(xiàn)出漸進(jìn)狀態(tài)，其中正常對(duì)照組和高劑量組區(qū)分的最好，即造模最好。從血清和尿液樣品相應(yīng)的loading圖上分別鑒定出了與肝毒性相關(guān)的11個(gè)和10個(gè)生物標(biāo)記物。采用單因素分析方法比較對(duì)照組和高劑量組生物標(biāo)記物的含量變化發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，高劑量組溶血性磷脂酰膽堿、肌酐酸、馬尿酸和N2-琥珀

7、酰-L-鳥氨酸含量下降，磷脂酰膽堿、膽酸、苯丙氨酸、色氨酸、苯乙酰甘氨酸、苯酚硫酸鹽、甲酚硫酸鹽、煙酰甘氨酸硫酸鹽和吲哚硫酸鹽含量上升。蓖麻堿致肝毒性的機(jī)制可能涉及到脂肪代謝、肝腸循環(huán)、氨基酸代謝、能量代謝和腸道菌群代謝等一系列代謝途徑的紊亂。根據(jù)這些生物標(biāo)記物的生理功能，從代謝組學(xué)角度推測(cè)蓖麻堿致肝毒性的機(jī)制可能涉及到磷脂質(zhì)、氨基酸、腸道菌群和能量等一系列代謝途徑的紊亂，為蓖麻堿致肝毒性的早期診斷、病理機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了一定的參考