鴨甲肝病毒1型和3型VP1蛋白中和性線性抗原表位的精確定位.pdf

1、鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis）由鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）和鴨星狀病毒（Duck astrovirus）引起，主要感染1～3周齡雛鴨，具有高度致死（死亡率90％以上）、傳播迅速的特點(diǎn)。其中DHAV型鴨肝炎呈世界范圍分布，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)極大的損失。
　　 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于DHAV的研究已經(jīng)從基因檢測(cè)、克隆測(cè)序、進(jìn)化樹分析等過(guò)渡到了對(duì)其基因組功能的研究，結(jié)構(gòu)與功能蛋白

2、質(zhì)的表達(dá)以及單克隆抗體的制備是此類研究的常用手段。本研究在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)制備了單克隆抗體4F8并對(duì)其所識(shí)別的抗原表位進(jìn)行了初步定位的基礎(chǔ)上，對(duì)初步定位區(qū)段進(jìn)行了進(jìn)一步精確定位并鑒定了4F8在DHAV其他血清型的VP1蛋白上的抗原表位，從而為DHAV的診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查、新型表位疫苗的研制提供了科學(xué)依據(jù)。研究主要包括以下內(nèi)容:
　　 1.抗DHAV-1單克隆抗體4F8中和活性的測(cè)定
　　 本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中用DHAV

3、-1全病毒粒子免疫BLAC/c小鼠后，取免疫小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，最后篩選出了能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4F8。本研究通過(guò)對(duì)小白鼠腹腔注射4F8雜交瘤細(xì)胞的方法制備了抗DHAV-1的單克隆抗體，通過(guò)定量病毒稀釋單抗的方法測(cè)定了單抗4F8對(duì)DHAV-1與DHAV-3的中和活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于100ELD50的DHAV-1，0.1mL的腹水蛋白含量為2.056 mg/mL的單抗4F8能保護(hù)50％以上鴨胚免于死亡的抗體稀釋

4、倍數(shù)為5.0，而對(duì)于100ELD50的DHAV-3，0.1mL的腹水蛋白含量為2.056 mg/mL的單抗4F8能保護(hù)50％以上鴨胚免于死亡的抗體稀釋倍數(shù)為9.8。研究結(jié)果表明單抗4F8對(duì)DHAV-1和DHAV-3均有一定的中和作用，但中和效價(jià)不高。同時(shí)，雖然單抗4F8是用DHAV-1免疫后制備的，但其對(duì)DHAV-1的中和活性不如對(duì)DHAV-3的中和活性高。
　　 2.單抗4F8在DHAV-1上識(shí)別線性表位的準(zhǔn)確定位研究

5、　　 本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中確定了4F8識(shí)別線性抗原表位且抗原表位為DHAV-1 VP1蛋白的第74～82位氨基酸。本研究在此基礎(chǔ)上本研究構(gòu)建了6個(gè)DHAV-1 VP1分段蛋白的pET-32a(+)重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Rosetta菌株中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物做SDS-PAGE鑒定表達(dá)后，再用單克隆抗體4F8分別對(duì)其進(jìn)行Western blot分析。根據(jù)Western blot結(jié)果結(jié)合引物設(shè)計(jì)推測(cè)單抗4F8識(shí)別的抗原

6、表位，結(jié)果表明，DHAV-1VP1蛋白的75～80位氨基酸為單抗4F8的抗原表位，即75GEIILT80。通過(guò)與 NCBI上發(fā)表的DHAV各血清型病毒序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該抗原表位在DHAV-1的VP1蛋白上高度保守，而DHAV-2和DHAV-3分離株均在該部分存在變異。
　　 3.單抗4F8對(duì)DHAV-2 VP1蛋白上的抗原表位進(jìn)行識(shí)別的研究
　　 DHAV-2為分離自臺(tái)灣的DHAV新血清型，目前僅在臺(tái)灣地區(qū)分離報(bào)道過(guò)。

7、根據(jù)NCBI上已發(fā)表的臺(tái)灣04G株DHAV-2的基因序列，本研究直接合成了DHAV-2的VP1基因，構(gòu)建了2個(gè)VP1分段蛋白的pET-32a(+)重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Rosetta菌株中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳鑒定表達(dá)后，用單克隆抗體4F8與表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，DHAV-2的VP1蛋白上不存在4F8可以識(shí)別的抗原表位。
　　 4.單抗4F8對(duì)DHAV-3的VP1蛋

8、白上進(jìn)行抗原表位識(shí)別的研究
　　 將DHAV-3與DHAV-1進(jìn)行病毒序列比對(duì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在75～80位氨基酸二者只有一個(gè)氨基酸的變異，針對(duì)這個(gè)比對(duì)結(jié)果，本研究構(gòu)建了4個(gè)DHAV-3 VP1分段蛋白的pET-32a(+)重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Rosetta菌株中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳確定表達(dá)后，用單克隆抗體4F8與表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，DHAV-3 VP1蛋白上75GE