九孔鮑和近江牡蠣泛素酶(UBE2D和UIP5)的分子生物學(xué)和功能研究.pdf

1、貝類是我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱之一，其中雙殼貝類牡蠣和單殼貝類鮑是主要的經(jīng)濟(jì)貝類品種。然而，隨著養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加，養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，養(yǎng)殖海區(qū)環(huán)境污染日益嚴(yán)重，病害發(fā)生日益頻繁，使得貝類養(yǎng)殖遭遇重大損失。泛素化修飾屬于蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在細(xì)胞的各種生命活動(dòng)進(jìn)程如細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為了探索泛素化修飾在貝類免疫反應(yīng)及抵御不良環(huán)境中的作用與機(jī)制，為貝類病害防治提供理論基礎(chǔ)，本研究克隆并鑒定了九孔

2、鮑泛素偶聯(lián)酶UBE2D(Ab-UBE2D)和近江牡蠣泛素連接酶UIP5(Ca-UIP5)，利用現(xiàn)代生物信息學(xué)分析手段，結(jié)合分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)，對(duì)貝類泛素—蛋白酶體系統(tǒng)的這兩種相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究。
　　 一、九孔鮑泛素偶聯(lián)酶UBE2D鑒定及功能研究
　　 從LPS刺激后的九孔鮑血淋巴細(xì)胞cDNA文庫中獲取了Ab-UBE2D的全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行了分析和鑒定。鮑UBE2D cDNA全長(zhǎng)1005bp，

3、包含一個(gè)編碼147個(gè)氨基酸的完整閱讀框。編碼蛋白含有一個(gè)特征性的UBCc催化支架結(jié)構(gòu)域、一個(gè)保守的Cys激活位點(diǎn)和21個(gè)泛素—鹽硫鍵反應(yīng)殘基，其氨基酸序列與酵母UBC4/5、人UBE2D1-4等基因的編碼氨基酸相似度在80％左右。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，Ab-UBE2D與酵母UBC4/5和人UBE2D等聚為一支，遠(yuǎn)離其他類型的泛素偶聯(lián)酶。組織表達(dá)分布研究表明:Ab-UBE2D在檢測(cè)的各個(gè)組織中都有表達(dá)，在血淋巴細(xì)胞、消化腺和鰓中表達(dá)量高于其他

4、組織。同時(shí)，LPS和Poly I:C刺激均可誘導(dǎo)Ab-UBE2D基因表達(dá)水平顯著上升，說明Ab-UBE2D具有廣泛的生物學(xué)功能，在免疫反應(yīng)中具有積極作用。為了進(jìn)一步研究Ab-UBE2D的生物學(xué)功能，表達(dá)和純化了Ab-UBE2D蛋白，并利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了鑒定。細(xì)胞免疫熒光顯示，Ab-UBE2D主要分布在血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。另外，體外泛素化檢測(cè)分析表明:Ab-UBE2D可以形成通過硫酯鍵連接的泛素—偶聯(lián)酶復(fù)合物，即具有泛素偶聯(lián)酶活性，并且

5、這種活性依賴于ATP供能，表明了泛素化修飾在軟體動(dòng)物鮑中的保守性。
　　 二、近江牡蠣UIP5的鑒定及功能研究
　　 從LPS刺激后的近江牡蠣血淋巴細(xì)胞cDNA文庫中獲取了Ca-UIP5全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行了分析和鑒定，這是軟體動(dòng)物中UIP5基因的首次報(bào)道。牡蠣UIP5cDNA全長(zhǎng)1831bp，包含一個(gè)編碼549個(gè)氨基酸的完整閱讀框。編碼蛋白的中部和后部分別含有一個(gè)由74個(gè)氨基酸殘基組成的U-box保守結(jié)構(gòu)域和一個(gè)39個(gè)氨基

6、酸殘基組成的RING結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Ca-UIP5編碼蛋白與其他模式動(dòng)物同源物的全長(zhǎng)氨基酸序列相似度在22％-29％，保守結(jié)構(gòu)域相似度在41％-50％。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，Ca-UIP5與人和斑馬魚的同源物聚在一起，與紫海膽和果蠅的同源物距離相對(duì)較遠(yuǎn)。組織表達(dá)分布研究表明:Ca-UIP5在各組織中都有表達(dá)，在消化腺、血淋巴細(xì)胞和鰓中表達(dá)量高于其他組織。同時(shí)LPS刺激可誘導(dǎo)Ca-UIP5基因表達(dá)水平顯著上升，說明Ca-UIP5可能直

7、接或間接地參與了機(jī)體的各種生物學(xué)過程，在免疫反應(yīng)中具有積極作用。為了進(jìn)一步研究Ca-UIP5的生物學(xué)功能，表達(dá)和純化了Ca-UIP5保守結(jié)構(gòu)域Ca-UD蛋白，并利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了鑒定。熒光免疫組化顯示，外套膜和性腺中Ca-UIP5蛋白主要分布于細(xì)胞核以及部分細(xì)胞膜上，消化腺中的陽性信號(hào)則主要集中在腺細(xì)胞的細(xì)胞之中，暗示了Ca-UIP5生物學(xué)功能及作用機(jī)制的多樣性。另外，體外泛素化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ca-UD在有ATP供能的條件下，可以發(fā)生泛素化修