二穗短柄草BdGF14d和BdGF14g基因的克隆及抗逆功能分析.pdf

1、多種不利環(huán)境因素包括干旱、高鹽、極端溫度等常常造成植物生長發(fā)育障礙，導致農(nóng)作物減產(chǎn)。發(fā)掘抗逆相關(guān)基因并解析其作用機制將有助于闡明植物抵御非生物逆境脅迫信號網(wǎng)絡(luò)通路，對改良植物尤其是農(nóng)作物的抗逆特性和遺傳育種具有重要意義。二穗短柄草（Brachypodium distachyon）與小麥（Triticum aestivum）有較近的親緣關(guān)系，隨著其基因組測序工作的完成，二穗短柄草作為新興的單子葉禾本科模式植物受到越來越多的關(guān)注。
　

2、　在本研究中，我們以二穗短柄草為研究對象，在其基因組中克隆了8個（包括一個可變剪接）14-3-3基因家族成員并分析了該基因家族在不同組織器官中及不同非生物逆境脅迫及信號分子處理下的表達模式；利用酵母雙雜交實驗分析了二穗短柄草14-3-3蛋白家族與AREB/ABF轉(zhuǎn)錄因子家族成員的相互作用關(guān)系；對經(jīng)前期分析得到的抗逆候選基因BdGF14d和BdGF14g進行蛋白亞細胞定位分析并通過在煙草（Nicotiana tabacum）中過表達BdG

3、F14d基因和BdGF14g基因，研究了其抗逆功能并分別對其抗逆機制進行了分析。
　　本文的研究內(nèi)容和主要研究結(jié)果如下：
　　1）利用生物信息學方法共鑒定了8個（包括一個可變剪接）二穗短柄草14-3-3基因家族成員，將其分別命名為BdGF14a、BdGF14b、BdGF14c1、BdGF14c2、BdGF14d、BdGF14e、BdGF14f和BdGF14g。氨基酸多序列比對分析結(jié)果表明二穗短柄草14-3-3蛋白家族成員在進

4、化上具有高度保守的特性。通過實時熒光定量PCR的方法，分析了二穗短柄草14-3-3基因家族成員在不同組織器官中及不同非生物逆境脅迫和信號分子處理下的轉(zhuǎn)錄表達模式。實驗結(jié)果表明，二穗短柄草14-3-3基因家族成員轉(zhuǎn)錄表達廣泛分布在莖、葉、幼穗等組織器官中，但在抽穗期的二穗短柄草根中的轉(zhuǎn)錄表達水平相對較低；不同家族成員在響應(yīng)不同的非生物逆境脅迫及信號分子處理時具有不同的表達模式。BdGF14d在NaCl處理中轉(zhuǎn)錄表達水平顯著上調(diào)，其它Bd1

5、4-3-3基因則有不同程度的下調(diào)。而在PEG處理中，BdGF14e轉(zhuǎn)錄表達水平則顯著上調(diào)，BdGF14f和BdGF14g在添加20％PEG60003h后顯著上調(diào)。在H2O2處理的樣本中，BdGF14b轉(zhuǎn)錄表達水平顯著上調(diào)，而BdGF14c1和BdGF14d則下調(diào)表達。在ABA處理的樣本中，BdGF14e和BdGF14f基因轉(zhuǎn)錄表達水平明顯上調(diào)，而BdGF14b和BdGF14g在處理1h后轉(zhuǎn)錄表達水平迅速上調(diào)，12h后則呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢。

6、
　　2）通過農(nóng)桿菌侵染煙草葉片下表皮的瞬時轉(zhuǎn)化實驗，檢測了二穗短柄草14-3-3蛋白BdGF14d和BdGF14g的亞細胞定位情況，結(jié)果表明BdGF14d蛋白和BdGF14g蛋白在細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜中均有分布。
　　3）利用酵母雙雜交技術(shù)，對二穗短柄草14-3-3蛋白家族與ABA信號通路相關(guān)的AREB/ABF轉(zhuǎn)錄因子家族成員的相互作用模式進行分析研究。結(jié)果表明，除了BdGF14c2蛋白具有自我激活功能之外，二穗短柄草1

7、4-3-3蛋白家族成員與AREB/ABF轉(zhuǎn)錄因子家族不同成員之間存在相互作用。其中，所有14-3-3蛋白均能與BdbZIP62蛋白相互作用，但均不與BdbZIP56-2和BdFDL36蛋白相互作用。BdGF14c1和BdGF14e蛋白均能與BdbZIP56-1、BdbZIP71、BdbZIP16、BdbZIP62、BdbZIP41和BdFDL2蛋白相互作用；BdGF14d蛋白只與BdbZIP71、BdbZIP62兩個AREB/ABF轉(zhuǎn)錄

8、因子相互作用；BdGF14a蛋白與BdbZIP56-1、BdbZIP16、BdbZIP62、BdbZIP41轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用；BdGF14b蛋白與BdbZIP56-1、BdbZIP71、BdbZIP62轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用；BdGF14f蛋白與BdbZIP71、BdbZIP16、BdbZIP62、BdFDL2、BdbZIP41轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用；BdGF14g蛋白與BdbZIP16、BdbZIP62、BdbZIP41AREB/AB

9、F轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用。
　　4）通過農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)基因方法，在煙草中過表達BdGF14d基因，獲得轉(zhuǎn)基因陽性株系，對其進行了抗鹽功能鑒定并分析了其抗鹽機制。BdGF14d過表達煙草在添加NaCl的MS固體培養(yǎng)基中的根長顯著長于野生型對照植株；在營養(yǎng)土中用NaCl處理35天后，BdGF14d過表達煙草植株的生長狀態(tài)顯著優(yōu)于野生型對照植株，其成活率顯著高于野生型和空載體對照植株。測量鹽脅迫處理后各轉(zhuǎn)基因株系及野生型煙草葉片中抗氧化酶

10、活力結(jié)果表明，BdGF14d基因過表達煙草株系的抗氧化酶活力顯著高于野生型對照植株；葉片中的過氧化氫含量、相對電導率、丙二醛含量、鈉離子水平顯著低于野生型對照植株；ABA信號通路相關(guān)基因NtNCED1，NtABF2，TobLTP1轉(zhuǎn)錄表達水平、相關(guān)離子通道基因包括質(zhì)膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運載體基因NtSOS1、液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運載體基因NtNHX2，NtNHX4轉(zhuǎn)錄表達水平、相關(guān)抗氧化酶基因NtCAT，NtPOX2轉(zhuǎn)錄表達水平顯著

11、高于野生型對照植株；在ABA及NaCl處理下，BdGF14d過表達煙草植株的氣孔關(guān)閉程度顯著大于野生型對照植株。
　　5）通過農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)基因方法，在煙草中過表達BdGF14g基因，篩選得到陽性轉(zhuǎn)基因植株，對其進行抗旱功能鑒定并分析了其抗旱機制。BdGF14g過表達煙草株系在甘露醇處理的MS固體培養(yǎng)基中，根長顯著長于野生型對照植株；在營養(yǎng)土中干旱處理25天后，BdGF14g過表達煙草株系的生長狀態(tài)顯著優(yōu)于野生型對照植株；澆水恢復

12、7天后，野生型及空載體對照煙草植株萎蔫、枯黃甚至死亡，而BdGF14g基因過表達煙草株系生長狀態(tài)良好。存活率統(tǒng)計結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草株系存活率顯著高于野生型及空載體對照。測量干旱處理15天后各轉(zhuǎn)基因株系及野生型煙草葉片中抗氧化酶活力，發(fā)現(xiàn)BdGF14g基因過表達煙草株系的抗氧化酶活力顯著高于野生型對照植株；葉片中的過氧化氫含量、離子滲漏、丙二醛含量顯著低于野生型對照植株；相對水含量、內(nèi)源ABA水平、ABA信號通路相關(guān)基因NtNCED1和