二穗短柄草BdWRKY2,BdWRKY7和BdWRKY43基因的克隆、表達分析和遺傳轉化.pdf

1、非生物逆境脅迫嚴重危害多種重要糧食作物（如小麥、大麥和燕麥等）的生長和發(fā)育，進而嚴重降低其產量，因此迫切需要分離非生物逆境反應相關基因、并闡明其功能，通過基因工程手段培育抗性作物新品種。二穗短柄草與小麥同屬于冷季型早熟禾亞科植物，遺傳關系密切，且二穗短柄草Bd21的全基因組的測序工作已經完成，基因克隆方便，是研究小麥功能基因的理想模式植物。轉錄因子WRKY是植物十大轉錄調節(jié)因子之一，能夠調節(jié)多種農藝性狀，其功能涉及發(fā)育、代謝、衰老、生物

2、和非生物逆境脅迫等。因此，二穗短柄草WRKY基因的克隆、表達模式分析以及遺傳轉化研究有望為麥類作物的遺傳改良提供理論支持。
　　本研究克隆了BdWRKY2，BdWRKY7和BdWRKY43基因，并對其進行了生物信息學分析、表達分析、亞細胞定位分析、轉化煙草以及初步的表型分析的工作。主要研究結果如下：
　　(1)通過檢索二穗短柄草WRKY基因數據庫和植物基因組數據庫，獲得BdWRKY2,BdWRKY7和BdWRKY43基因的c

3、DNA和DNA序列，利用Primer Premier5.0設計目的基因的特異性引物，成功克隆了BdWRKY2/7/43的基因。
　　(2)利用DNAMAN和MEGA5.0對BdWRKY轉錄因子進行多序列比對和進化分析，結果顯示BdWRKY2屬于IIc亞家族，BdWRKY7屬于I家族，BdWRKY43屬于III家族。
　　(3)利用半定量RT-PCR技術分析目的基因BdWRKY2/7/43的器官差異性和在非生物逆境脅迫及分子信

4、號處理下的表達水平。結果表明這3個基因在幼葉中的表達量都比較高，且均響應多種非生物脅迫，具體表現為：
　　BdWRKY2基因受PEG,ABA,NaCl,H2O2,heat的誘導，表達上調；BdWRKY7基因受PEG,NaCl,H2O2，heat,cold的誘導，表達上調；BdWRKY43基因受PEG,heat的誘導，表達上調，受ABA,NaCl,H2O2,cold的誘導，表達下調。
　　(4)將已獲得的目的基因BdWRKYs

5、構建到pCAMBIA1304表達載體上，獲得pCAMBIA1304-BdWRKY植物過表達載體。
　　(5)基因槍介導的洋蔥表皮細胞的瞬時表達分析顯示，轉錄因子BdWRKY2，BdWRKY7和BdWRKY43均定位于細胞核。
　　(6)利用葉盤法轉化煙草，成功獲得了13株轉BdWRKY2、8株轉BdWRKY7和12株轉BdWRKY43基因的煙草株系。同時，利用半定量RT-PCR技術進一步分析了部分BdWRKY2/7/43基因

6、過表達煙草株系的轉錄水平。
　　(7)分析了不同轉Bd WRK Y7基因株系后代在干旱脅迫下的表型，發(fā)現過表達BdWRKY7基因降低了轉基因煙草對干旱脅迫的耐受性。
　　本研究成功克隆了BdW RK Y2/7/43基因，并轉化了煙草，進而分析了部分轉基因株系外源基因的轉錄水平；另外，還分析了BdWRKY2/7/43基因在非生物脅迫及信號分子處理下的表達模式，并分析了不同轉BdWRKY7基因株系后代在干旱脅迫下的表型，為后續(xù)W