二穗短柄草VERNALIZATION1基因功能及其直接下游靶基因分析.pdf

1、VERNALIZATION1（VRN1）為溫帶禾本科植物從營養(yǎng)生長進(jìn)入生殖生長的關(guān)鍵性基因，對小麥的抽穗以及花器官的發(fā)育起重要作用?；邴滎愔参锏幕蚪M相對較大，生長周期較長，遺傳轉(zhuǎn)化較困難等特點，目前對麥類植物VRN1基因的研究還比較少。作為溫帶禾本科中響應(yīng)春化的關(guān)鍵基因，VRN1在整個開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的具體作用，VRN1、VRN2及FT三者在整個開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的上下游關(guān)系等一系列的分子機理尚未明確。
　　二穗短柄草與大麥、小麥等

2、重要的糧食作物親緣關(guān)系較近，是新型的溫帶禾本科模式植物。本研究主要以二穗短柄草生態(tài)型Bd21為材料。為探索二穗短柄草中VRN1的功能，我們克隆了二穗短柄草BdVRN1 cDNA，分別構(gòu)建CaMV35S及ZmUbi啟動的VRN1過表達(dá)載體，并遺傳轉(zhuǎn)化野生型二穗短柄草。長日照條件下，強啟動子ZmUbi能夠?qū)е轮参飿O早開花，95％以上的組培苗在分化階段即可開花，且有些極早花植株葉片有向穗分化的趨勢。與野生型相比，CaMV35S啟動BdVRN1

3、過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株提前一到兩片葉開花。表明VRN1促進(jìn)植物開花的程度與其表達(dá)量有密切關(guān)系。外源基因表達(dá)量越高，VRN1促進(jìn)植物開花的效果越明顯，表現(xiàn)出的早花表型也越強烈。
　　為進(jìn)一步探索VRN1的功能，本研究同樣做了短日照下ZmUbi啟動BdVRN1過表達(dá)實驗。短日照下過表達(dá)BdVRN1同樣能導(dǎo)致植物早開花。轉(zhuǎn)基因植株再生過程中，分化培養(yǎng)基上同樣會有早花植株出現(xiàn)。鑒于短日照條件下，內(nèi)源性刀、VRN1等開花促進(jìn)因子本底水平較低。與長

4、日照相比，轉(zhuǎn)基因植株早花表型稍弱，僅有5％左右的植株會出現(xiàn)剛剛分化即頂著穗長出的極早花表型。實驗結(jié)果表明無論長短日照下，VRN1都是植物控制開花的關(guān)鍵基因。
　　小麥VRN1m mavp突變體表現(xiàn)為永不開花，為進(jìn)一步驗證二穗短柄草中VRN1的功能，本研究構(gòu)建了BdVRN1 RNAi載體并遺傳轉(zhuǎn)化野生型二穗短柄草。根據(jù)不同的沉默效果，BdVRN1 RNAi轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出不同程度的晚花表型。開花葉片數(shù)在9～15片葉不等。BdVRN1

5、 RNAi沉默實驗表現(xiàn)出晚花表型，進(jìn)一步證明了VRN1的確能夠促進(jìn)植物開花，并進(jìn)一步確定了其在植物開花調(diào)控中的關(guān)鍵作用。
　　長短日照下過表達(dá)BdVRN1均能導(dǎo)致植物出現(xiàn)早花表型，但對其早花花器官解剖分析，并未發(fā)現(xiàn)無明顯異常。這表明，VRN1的下游可能存在影響花器官發(fā)育的直接靶基因。為進(jìn)一步探索控制開花的分子機理，我們檢測了轉(zhuǎn)基因植株中開花相關(guān)基因的表達(dá)量變化。在BdVRN1過表達(dá)及RNAi沉默轉(zhuǎn)基因植株中，我們檢測的開花相關(guān)基因

6、，尤其是FT的兩個同源基因，其表達(dá)量均無無發(fā)生太大變化。這表明，溫帶禾本科中FT可能位于VRN1的上游起作用，F(xiàn)T通過上調(diào)VRN1的表達(dá)來促進(jìn)植物開花。
　　為尋找VRN1的直接下游靶基因，本研究構(gòu)建了小標(biāo)簽載體。過表達(dá)融合蛋白實驗表明，只有后端標(biāo)記的BdVRN1-3xHA載體對VRN1功能影響不大，轉(zhuǎn)基因植株能出現(xiàn)早花表型。前端以及兩端標(biāo)記的小標(biāo)簽載體，過表達(dá)都無早花現(xiàn)象，他們影響了VRN1的功能，后續(xù)實驗不能使用。此外，本研究