農(nóng)桿菌介導(dǎo)的BAR基因在二穗短柄草中的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、模式植物的研究是分析植物遺傳特性的一種重要方法，近幾年，二穗短柄草（Brachypodium distachyon）做為一種新型的禾草模式植物被廣泛應(yīng)用，其最大特點是：生長周期短，基因片段小。隨著試驗室研究的不斷深入，人們更加清楚的認(rèn)識到它做為禾草模式植物的可能性。本試驗以二穗短柄草二倍體品種BDR018為材料，建立了一個高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系。主要研究結(jié)果如下： 1．二穗短柄草離體再生體系的優(yōu)化試驗。試驗主要以二穗短柄草未成熟胚為

2、外植體，研究了胚的大小對愈傷組織的誘導(dǎo)和再生的影響。取DB21，BD21-3，BDR018三個品種的未成熟胚，將其分為小于0．3mm、0．3mm～1mm和大于1mm三個等級進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個品種中大小介于0．3mm～1mm之間的未成熟胚誘導(dǎo)率均較高，分別為85%、85%、74%，其中BDR018愈傷的再生能力最強(qiáng)，白化率最低。 2．BDR018遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。本試驗用攜帶T-DNA質(zhì)粒PDM805的菌株AGL1，對

3、來自未成熟胚的胚性愈傷進(jìn)行浸染，bar基因被用作選擇標(biāo)記基因，在轉(zhuǎn)化后的抗性愈傷篩選培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基中，均添加5mg/L的bialaphos作為選擇劑，每2～3周繼代一次。結(jié)果顯示，年齡在5～8周范圍內(nèi)的愈傷轉(zhuǎn)化效率較高，平均轉(zhuǎn)化效率為21．1%。 另外，還比較了Yep、MG/L、MS2．5三個液體培養(yǎng)基對bar基因轉(zhuǎn)化效率的影響，其中MG/L最佳，加入乙酰丁香酮后，最高效率可達(dá)42．9%，這是所報道的相同愈傷年齡下最高轉(zhuǎn)化效

4、率。 3．抗性植株的檢測。取攜帶質(zhì)粒PDM805的轉(zhuǎn)化植株的新鮮葉片進(jìn)行葉片測試和GUS染色測試，結(jié)果顯示，葉片測試全部表現(xiàn)為陽性轉(zhuǎn)基因植株；GUS檢測中有91．4%的植株葉片呈現(xiàn)不同程度的藍(lán)色，有藍(lán)色出現(xiàn)的葉片說明了bar基因穩(wěn)定表達(dá)。 提取轉(zhuǎn)化植株的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，除了非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暌酝猓械霓D(zhuǎn)基因植株均擴(kuò)增出了400bp的bar基因cDNA片斷。說明bar基因得到了穩(wěn)定表達(dá)并表現(xiàn)出對除草劑