農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GNA基因?qū)瘫究撇萜翰莸倪z傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、狗牙根[Cynodon dactylon(L．)Pars．]、結(jié)縷草(Zoysia japonica Steud．)和高羊茅(Festuca arundinacea)是國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的重要禾本科草坪草。由于草坪種植方式和養(yǎng)護(hù)方法的局限性，使草坪草容易受到害蟲(chóng)的侵襲，而且蟲(chóng)害蔓延速度較快。因此，利用植物基工程技術(shù)改良其抗蟲(chóng)性，對(duì)防治害蟲(chóng)的危害，減少殺蟲(chóng)劑的使用，保護(hù)環(huán)境，節(jié)約草坪維護(hù)費(fèi)用具有重要的意義。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是植物基因工程中的常用方

2、法，具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化率高、費(fèi)用低廉的特點(diǎn)。 本論文對(duì)狗牙根、結(jié)縷草和高羊茅的組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)進(jìn)行了研究，對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗蟲(chóng)基因——雪花蓮凝集素(Galanthus nivalis agglutinin，GNA)基因?qū)@3種禾本科草坪草的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行了探索。經(jīng)PCR方法檢測(cè)，已獲得轉(zhuǎn)基因的陽(yáng)性植株。其主要研究結(jié)果如下： 1.以狗牙根、結(jié)縷草、高羊茅種子為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，狗牙根和結(jié)縷草最佳愈傷組織誘導(dǎo)培

3、養(yǎng)基為N6培養(yǎng)基，分別添加2mg／L和4mg／t,2，4-D時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為74.67％和86.67％；MS培養(yǎng)基較適合高羊茅的組織培養(yǎng)，當(dāng)2,4-D濃度為11mg／L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為73.33％。 2.狗牙根愈傷組織在1／2 MS+6-BA 2mg／L+NAA 0.5mg／L培養(yǎng)基上可分化，分化率為28.13％，分化芽在1／2 MS培養(yǎng)基上即可生根；結(jié)縷草愈傷組織分化培養(yǎng)基為1／2 N6+0.1 mg／L 2

4、，4-D，分化率為46.88％，生根培養(yǎng)基為MS+NAA0.5mg／L+KT 0.5mg／L；高羊茅愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+1 mg／L 2,4-D+6-BA2mg／L，分化率為77.78％，生根培養(yǎng)基為原分化培養(yǎng)基。 3.添加一定濃度的殼聚糖(Chitosan)對(duì)狗牙根和結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)和分化均有一定程度的促進(jìn)作用。當(dāng)添加一定濃度的殼聚糖時(shí)，狗牙根和結(jié)縷草的愈傷組織誘導(dǎo)率均能夠顯著提高，狗牙根愈傷組織誘導(dǎo)率最高提高至86.

5、67％，結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)率最高提高至98.33％；狗牙根和結(jié)縷草愈傷組織分化率分別提高至35.00％和78.13％。 4.狗牙根遺傳轉(zhuǎn)化體系中，用于侵染愈傷組織的農(nóng)桿菌菌液最佳OD600值約為0.4，侵染時(shí)間為30min；結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化的最佳條件和狗牙根相同；侵染高羊茅愈傷組織的農(nóng)桿菌菌液最佳OD600值約為0.5，侵染時(shí)間為20min。共培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)入附加抗生素的再生培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，愈傷組織分化出抗性芽。抗性芽在附加