農(nóng)桿菌介導(dǎo)的SAP1、GNA基因?qū)Π兹~等草坪草的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、草坪是城市綠化的重要組成部分，其中雙子葉草坪草，如白三葉(Trifolium repens)、紅三葉(Trifolium pretense)、百脈根(Lotus corniculatus Linn)、馬蹄金(Dichondra repens Forst)等作為重要的觀賞性草坪草在現(xiàn)代草坪建設(shè)中有著極為重要的應(yīng)用價值，但是由于單一草種大面積種植、高水高肥的養(yǎng)護，使得草坪草極易受各種病蟲害侵襲，其中病害包括白粉病、白絹病、萎蔫病等，蟲害包括

2、斜紋夜蛾、草地螟、葉蟬、蚜蟲等。 采用植物基因工程的方法可以對這些雙子葉草坪草的抗性和品質(zhì)進行改良。其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是目前研究較透徹，較常規(guī)、較成熟的轉(zhuǎn)化手段之一，具有操作簡便、費用低廉、轉(zhuǎn)化效率高等特點。 本論文建立并優(yōu)化了草坪草馬蹄金、白三葉和紅三葉的組織培養(yǎng)及植株再生體系，建立了農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的抗病基因SAP1基因和抗蟲基因GNA基因?qū)Π兹~的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了白三葉的轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果

3、如下： 1.不同激素配比對馬蹄金愈傷組織誘導(dǎo)影響不同。以馬蹄金下胚軸、子葉和種子為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素濃度分別為：2,4-D 1mg／L+NAA0.5mg／L+KT 0.1mg／L、2,4-D 2mg／L+6-BA 0.1mg／L、2,4-D 0.5mg/L+NAA 0.1 mg/L;不同外植體產(chǎn)生的愈傷組織的質(zhì)量不同，以馬蹄金下胚軸和初生子葉為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織較為致密，優(yōu)于以種子為外植體產(chǎn)生的愈傷組織。但是馬蹄金的

4、愈傷組織分化和植株再生較為困難。 2.以白三葉吸脹子葉為外植體，在添加6-BA 0.5 mg／L+NAA 0.05 mg／L的MS培養(yǎng)基上可分化出叢生芽，分化率為75.00％；叢生芽在原培養(yǎng)基上生根。以紅三葉子葉為外植體，在添加6.BA 1 mg／L+NAA 0.05 mg／L+1mg／L KT的MS培養(yǎng)基上也可直接分化，分化率為73.75％，最佳生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg／L。 3.選用自三葉吸脹子葉為外植

5、體，將攜帶SAP1基因的農(nóng)桿菌菌液離心后，去上清，并用無激素1／2MS液體培養(yǎng)基懸浮使OD600≈0.2，侵染白三葉吸脹子葉35min；攜帶GNA基因的農(nóng)桿菌菌液侵染外植體的最佳OD600值約為0.3，侵染25min；共培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)入附加有45mg／L卡那霉素和400mg／L羧芐青霉素的再生培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg／L+NAA 0.05 mg／L上選擇培養(yǎng)28d后，子葉柄再生出抗性芽，轉(zhuǎn)化率分別達到26.32％和28.21％