用農(nóng)桿菌浸種法建立白三葉和中華結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、遺傳轉(zhuǎn)化是植物遺傳改良和基因功能研究的重要工具。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以沖破物種界限，實(shí)現(xiàn)種間遺傳育種，并改良現(xiàn)有的物種性狀。應(yīng)用于植物新品種的培育和改良研究，是篩選培育優(yōu)良品種極為便捷和有效的途徑。 白三葉和中華結(jié)縷草都是品質(zhì)優(yōu)良的草種，具有外觀優(yōu)美、適應(yīng)性強(qiáng)、抗性強(qiáng)、耐踐踏、耐刈割、白三葉根系發(fā)達(dá)，中華結(jié)縷草的根狀匍匐莖十分發(fā)達(dá)，都具有很好的保持水土的作用，在園林綠化中應(yīng)用較多，同時(shí)白三葉營(yíng)養(yǎng)豐富、產(chǎn)草量高是優(yōu)良的牧草。

2、本研究以白三葉和中華結(jié)縷草的萌動(dòng)種子為轉(zhuǎn)化受體，利用NPT-Ⅱ篩選基因?qū)τ绊戅r(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化外部因素進(jìn)行了深入探索，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，建立了農(nóng)桿菌浸種法的遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過PCR檢測(cè)初步驗(yàn)證基因已經(jīng)整合到植物基因組。主要研究結(jié)果如下： 1.種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白三葉種子內(nèi)部細(xì)胞分裂活躍期在催芽后的0-3h。20％NaoH浸泡20min處理對(duì)中華結(jié)縷草種子打破休眠效果較好，其內(nèi)部細(xì)胞分裂活躍期在催芽后的第5-9d。

3、2.通過研究不同卡那霉素濃度及處理時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)及植株生長(zhǎng)的影響，建立適宜的卡那霉素篩選體系。本研究確定白三葉種子Kan篩選最適濃度為50mg/L處理時(shí)間為為6-8d。中華結(jié)縷草種子Kan篩選最適濃度為75mg/L，處理時(shí)間為6-10d。 3.遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適宜白三葉的遺傳轉(zhuǎn)化體系為為種子催芽1h，農(nóng)桿菌菌液OD600為0.9，真空處理，抽5im+間歇1min+抽5im+間歇1min+抽5im+間歇1min，20

4、℃恒溫振蕩培養(yǎng)24h，共培養(yǎng)1d；適宜中華結(jié)縷草的遺傳轉(zhuǎn)化體系為種子催芽6-7d，農(nóng)桿菌菌液OD600為0.9，真空處理，抽5im+間歇1min+抽5im+間歇1min+抽5im+恫歇1min，20℃恒溫振蕩培養(yǎng)48h，共培養(yǎng)2d。 4.以未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的植株作為陰性對(duì)照，以質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增NPT-Ⅱ、GUS基因部分片段。對(duì)轉(zhuǎn)化后具有卡那霉素抗性的植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明部分遺傳轉(zhuǎn)化植株擴(kuò)增出的條帶和質(zhì)粒中的目