二穗短柄草Ds轉座群體的構建與利用.pdf

1、二穗短柄草是一種新興的溫帶禾本科模式植物，對食品、牧草和能源等相關領域的研究具有重要的價值。二穗短柄草同擬南芥一樣具有諸多優(yōu)點:基因組小、植株小、生長周期短、自花授粉、易轉化等。在最近幾年，有關二穗短柄草的研究取得了飛速的發(fā)展，主要依賴兩個方面，一是二穗短柄草Bd21全基因組測序的完成，二是二穗短柄草農桿菌遺傳轉化技術的突破。
　　 研究基因的功能，首先要獲得相關突變體材料。目前擬南芥和水稻基本實現了全基因組的飽和插入突變，而二

2、穗短柄草突變體材料的收集工作還處在起步階段。二穗短柄草突變體材料主要通過兩條途徑獲得:第一條途徑是化學誘變（如EMS誘變）;第二條途徑是T-DNA插入突變，預期2013年二穗短柄草T-DNA插入突變總數量達到5萬份，而二穗短柄草實現飽和突變至少需要20萬份。這兩種誘變方式各有優(yōu)點和缺點，化學誘變前期工作量小，可以快速的獲得大量突變體，但是后期定位到相關基因比較困難，需要花費大量的時間。而T-DNA插入突變正好相反，前期需要花費大量的勞動

3、力和資金，但是在后續(xù)階段可以非常方便地定位到T-DNA插入位置，獲得相關基因的信息?？紤]到節(jié)省時間、勞動力、資金以及高效等方面的因素，本論文主要涉及二穗短柄草Ds轉座群體的構建與分析。
　　 Ac/Ds轉座系統目前在擬南芥、煙草和水稻等植物中廣泛應用。Ac/Ds轉座系統的特點是:偏向于插入到含基因區(qū)域，轉座距離相對較近，轉座后往往在原位點留下8bp的重復序列即足跡。理論上只要有Ac-TPase的存在，Ds就存在一定概率發(fā)生跳躍，

4、會導致原來的Ds插入不穩(wěn)定。為克服Ac/Ds轉座系統的缺點，本篇論文使用了2個誘導型Ds轉座系統:乙醇誘導型Ds系統(pHL1)，地塞米松誘導型Ds系統(pHL2)。pHL1在外源施加乙醇的條件下，能夠產生AcTPase，促使Ds跳躍，產生新的插入突變。pHL2載體Ac-TPase與GR屬于融合蛋白，在外源添加地塞米松的條件下，融合蛋白能夠進入到細胞核，促使Ds跳躍，產生新的插入突變。通過誘導系統，既能保證Ds的穩(wěn)定，又能調控Ds跳躍。

5、
　　 本研究的目的是，通過構建高密度的T-DNA群體，在外源添加誘導劑的情況下，誘使Ds跳躍，快速地獲得大量新的插入突變，實現二穗短柄草全基因組飽和突變;同時利用Ds轉座的特點，對Ds附近的基因實現定向插入失活。
　　 目前大約獲得了1000份pHL1、p-HL2和組成型Ac/Ds T-DNA系。對pHL1用乙醇誘導后，能夠檢測到Ac-TPase表達量顯著上升，部分植株最高表達量上升200倍以上。同時對pHL1不同植株

6、間的Ac-TPase本底水平進行分析，不同植株之間表現不同差異。通過PCR檢測的方式對誘導過后的pHL1植株Ds瞬時跳躍進行鑒定，挑選13個株系，檢測到3個株系Ds發(fā)生跳躍;pHL2用地塞米松誘處理后，從10個株系檢測到8個株系Ds發(fā)生跳躍;組成型Ac/Ds系統，半定量檢測到Ac-TPase的表達，同時在檢測的10個株系中檢測到9個株系Ds發(fā)生跳躍。同時對pHL1、 pHL2和組成型Ac/Ds系統Ds跳躍后獲得的31個測序結果分析，結果

7、表明Ds跳躍后會從原來插入位置帶走部分堿基，或者插入部分堿基。
　　 構建T-DNA高密度插入群體的過程中，獲得了一份油菜素內酯合成缺失體材料，通過T-DNA定位和進化樹分析，定位到一個brassinosteroid C6-oxidase基因。利用brassinosteroid C6-oxidase基因組全長進行互補試驗，互補后的植株恢復到野生型。對純合子材料外源添加BR，能夠部分恢復到野生型，進一步證實該基因與油菜素內酯的合成