稻瘟病菌Egh16家族基因的敲除與稻瘟病菌對(duì)二穗短柄草的致病性研究.pdf

1、(一)Egh16家族基因的敲除與功能分析
　　 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起水稻的重要病害——稻瘟病,了解其致病機(jī)制對(duì)稻瘟病菌的防治意義重大。同時(shí),作為絲狀真菌致病機(jī)理與分子生物學(xué)研究的重要模式,稻瘟病菌有著典型的侵染過(guò)程,包括產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)和附著孢的分化。稻瘟病菌功能基因的研究可以為其它絲狀真菌的研究提供研究思路。稻瘟病菌侵入前過(guò)程,特別是附著孢的分化與形成,已經(jīng)有很好的研究基礎(chǔ),但病菌的侵染循環(huán)中仍然

2、有多個(gè)環(huán)節(jié)的機(jī)制十分不清楚,例如侵入后病菌的定殖、菌絲分化和擴(kuò)展的機(jī)制、各細(xì)胞器在侵染中的作用等等。
　　 Egh16是通過(guò)差減雜交方法在小麥白粉病菌(Blumeria graminis)中首先發(fā)現(xiàn)的一類在侵入后特異表達(dá)的基因。在多種植物病原真菌中都發(fā)現(xiàn)其同源基因,其中包括稻瘟病菌中兩個(gè)已知的重要致病相關(guān)基因GAS1和GAS2。另外,在鐮刀菌中,其同源基因也在侵入后特異表達(dá)。因此,推測(cè)Egh16是植物病原真菌中一類參與致病過(guò)程的

3、重要的基因家族。通過(guò)同源基因檢索,我們?cè)诘疚敛【蚪M中獲到8個(gè)Egh16基因(包括GAS1與GAS2)。為了進(jìn)一步明確Egh16基因家族基因與致病性的關(guān)系,包括在附著胞形成、侵入及侵入后生長(zhǎng)過(guò)程中的作用等,本研究克隆了稻瘟病菌的3個(gè)Egh16家族基因MG02253、MG00703、MG09875,運(yùn)用基因敲除的方法獲得了3個(gè)基因的突變體,并初步分析了突變體的表型。結(jié)果如下:
　　 1 利用小麥白粉病菌Egh16基因蛋白序列,在

4、稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)blast程序進(jìn)行同源序列檢索,檢索到8個(gè)假設(shè)基因(MG02253、MG00703、MG09875、MG03504、MG00992、MG11595、GAS1、GAS2)。序列分析表明,MG02253基因開放閱讀框長(zhǎng)度為1067bp,包含、1個(gè)內(nèi)含子,2個(gè)外顯子,編碼區(qū)總長(zhǎng)度為843bp,編碼280氨基酸殘基的多肽:MG00703基因開放閱讀框長(zhǎng)度為1053bp,包含1個(gè)內(nèi)含子,2個(gè)外顯子,編碼區(qū)總長(zhǎng)度為969b

5、p,編碼322氨基酸殘基的多肽。MG09875基因開放閱讀框長(zhǎng)度為925bp,包含1個(gè)內(nèi)含子,2個(gè)外顯子,編碼區(qū)總長(zhǎng)度為828bp,編碼275氨基酸殘基的多肽。
　　 2 通過(guò)構(gòu)建基因置換載體和兩次ATMT轉(zhuǎn)化,其中,MG02253基因得到75個(gè)轉(zhuǎn)化子,MG00703基因得到72個(gè)轉(zhuǎn)化子,MG09875基因得到73個(gè)轉(zhuǎn)化子。通過(guò)PCR和Southern雜交驗(yàn)證,每個(gè)基因在其中鑒定出6個(gè)突變子,每個(gè)突變子基因編碼區(qū)的90％被HPH

6、基因所取代。各基因隨機(jī)選取2個(gè)突變體進(jìn)行表型分析。
　　 3 通過(guò)Southern分析,明確了MG02253、MG00703、MG09875三個(gè)基因在Guy11菌株基因組中均為單拷貝。
　　 4 各基因突變子在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與生長(zhǎng)速度無(wú)明顯改變,包括在N饑餓、C饑餓或高滲脅迫條件下,菌落形態(tài)及生長(zhǎng)速度與野生型比較也無(wú)明顯改變。
　　 5 將各基因的突變體的孢子懸浮液滴在Terylene膜表面誘導(dǎo)萌發(fā)與附著

7、胞的形成。結(jié)果顯示,所有菌株的孢子幾乎全部萌發(fā),突變體與野生型的萌發(fā)速度幾乎無(wú)差別,附著孢形成率達(dá)到95％以上,且可正常侵入,形成侵染菌絲。
　　 6 各基因突變體與野生型和隨機(jī)插入菌株均能產(chǎn)生典型的黃褐色病斑,差別不明顯,且致病能力較一致。
　　 7 各基因突變子在OMA培養(yǎng)基上與2539菌株交配,子囊殼的產(chǎn)生不受影響,不影響稻瘟病菌的有性生殖。
　　 (二)稻瘟病菌對(duì)二穗短柄草的致病性研究
　　 作為

8、植物與病原真菌互作研究中模式生物,稻瘟病菌與不同寄主(甚至非寄主)之間的互作及不同互作系統(tǒng)之間的異同,對(duì)于明確真菌與植物互作機(jī)理以及發(fā)掘新的抗性資源具有積極意義。而到目前,稻瘟病菌與其他寄主的互作研究和應(yīng)用還相對(duì)較少。二穗短柄草(Brachypodium distachyon)是一種新型的禾本科模式植物,對(duì)多種重要的植物病原真菌敏感,有望成為稻瘟病菌與寄主互作的研究材料之一。通過(guò)探索稻瘟病菌對(duì)二穗短柄草的接種與發(fā)病條件,觀察二穗短柄草的

9、發(fā)病特點(diǎn),并與大麥上的發(fā)病情況進(jìn)行比較,本研究初步建立了稻瘟病菌對(duì)二穗短柄草的接種方法和發(fā)病體系。主要結(jié)果如下:
　　 1.在人為接種稻瘟病菌的條件下,二穗短柄草的葉片、葉鞘、莖稈、穗部均可獲病。利用稻瘟病菌分生孢子懸浮液對(duì)二穗短柄草苗期進(jìn)行活體或離體接種,都能引發(fā)典型病斑。
　　 2.與同等條件下的大麥相比,二穗短柄草葉片上病斑的出現(xiàn)時(shí)間及發(fā)展速度更接近水稻。同時(shí),二穗短柄草葉片上的接種和發(fā)病條件比水稻更易控制,病斑更