稻瘟病菌Magnaporthe oryzae高效轉(zhuǎn)化文庫的構(gòu)建.pdf

1、稻瘟病菌能引起水稻上的一種重要病害-稻瘟病，了解其致病過程和機理對于防治稻瘟病有重要作用。同時，作為絲狀真菌致病機理與分子生物學(xué)研究的重要模式菌，M.oryzae功能基因的克隆對于了解其他病原真菌與寄主的互作也具有重要意義。基因文庫是克隆基因并研究其功能的重要手段，大容量的基因文庫結(jié)合有效的轉(zhuǎn)化方法，是通過表型互補進(jìn)行基因克隆的基礎(chǔ)。特別是條件突變體(如溫度敏感型突變體等)，通過表型互補克隆相關(guān)基因是一種基本的方法。本研究構(gòu)建了稻瘟菌C

2、osmid基因組文庫，為ATMT基因組文庫的構(gòu)建制備了所需的基因組DNA和處理了載體pBHT2，同時對稻瘟病菌電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)行了初步探索，為進(jìn)一步通過表型互補克隆相關(guān)基因打下了基礎(chǔ)?，F(xiàn)總結(jié)如下： 1)稻瘟病菌cosmid基因組文庫構(gòu)建采用SuperCos1載體構(gòu)建了稻瘟病菌菌株Guy-11基因組文庫。利用SDS及蛋白酶K法提取高質(zhì)量基因組DNA，并用4個堿基識別位點的限制性內(nèi)切酶Sau3AI對基因組進(jìn)行不完全酶切，獲得大小約40kb

3、的基因組片段，連接包裝后，轉(zhuǎn)染XL1-Blue MR細(xì)菌，最終獲得4.0×104個粘?？寺?，相當(dāng)于每微克基因組DNA約產(chǎn)生105個粘?？寺?，粘?？寺』旌嫌?5％甘油中并于-70℃下保存。對50個隨機重組子分析表明，98％的重組子含有外源DNA片段，片段平均大小為40.5kb。按照稻瘟病菌基因組DNA大小為40Mb計算，庫容量已高達(dá)31.75。同時，根據(jù)Clarke和Carbon公式N=ln(1-p)/ln(1-f)計算分析表明，理論上從

4、該文庫中篩選到任一DNA序列的概率在99.99％以上。對擴(kuò)增保存后文庫菌液滴度測定顯示該文庫滴度約為4.6×108cfu/ml，而進(jìn)行3次反復(fù)凍融后，其滴度仍可達(dá)4.0×108cfu/ml。各項實驗結(jié)果均表明本實驗構(gòu)建的粘?；蚪M文庫質(zhì)量比較高，為進(jìn)一步功能基因的篩選分離提供了保障。 2)構(gòu)建稻瘟病菌ATMT庫所需基因片段的制備及載體的處理要采用pBHT2質(zhì)粒Sau3A1酶切載體構(gòu)建稻瘟病菌基因組文庫，利用SDS及蛋白酶K方法提