利用啟動子陷阱技術(shù)（Promoter trapping）構(gòu)建稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）突變體庫.pdf

1、稻瘟病是水稻上重要的病害之一,其病原為子囊菌Magnaporthe grisea.了解 M.grisea的致病機(jī)理不僅有利于稻瘟病的防治,而且作為研究植物病原真菌與寄主互作的理想模式系統(tǒng),對于了解其它真菌的致病機(jī)理也有重要意義.致病相關(guān)基因的克隆和分析是達(dá)到這一目標(biāo)的有效途徑.突變體的獲得及表型分析是鑒定致病相關(guān)基因的有效策略.獲得突變體的方法很多,如限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)等.然而,這些方法不能研究以下

2、基因:在實(shí)驗室條件下功能上多余的基因;在多個水平上都有作用的基因;低水平表達(dá)的重要基因.啟動子陷阱的方法,并不需要產(chǎn)生可見的功能缺陷,只需根據(jù)報告基因的表達(dá)就可將轉(zhuǎn)化子篩選出來,然后通過啟動子陷阱載體上的已知序列克隆目的基因.該研究,將啟動子陷阱的技術(shù)應(yīng)用于稻瘟病菌,通過構(gòu)建啟動子陷阱載體,利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化,建立的突變體庫.研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建了啟動子陷阱載體pEGFP-HPH和pCB1003-EGFP,均具有具有潮霉素抗性基

3、因和無啟動子的eGFP基因;2.建立了稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化效率達(dá)到40-60個突變體/微克DNA;3.獲得突變體1077株,通過熒光顯微鏡檢測,489株突變體熒光表達(dá),eGFP基因表達(dá)率45.4％;生長速度明顯比野生型減慢的突變體3株;菌落白色的突變體9株;產(chǎn)孢減少的有35株;致病性有所降低的菌株18株;隨機(jī)挑取8株突變體進(jìn)行Southern雜交分析,可以雜交到強(qiáng)弱不同的信號.實(shí)驗數(shù)據(jù)表明,啟動子陷阱技術(shù)具有良好的前景,通過這種方