二色補血草LbGRP基因的克隆和抗逆性分析.pdf

1、干旱、低溫和高鹽是嚴(yán)重影響作物生長發(fā)育及產(chǎn)量的環(huán)境脅迫因子。許多研究表明LbGRP(glycine-rich RNA-binding protein)基因在植物的抗寒和抗鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究從二色補血草(Limonium bicolor)中克隆得到的LbGRP基因.首先，研究了該基因在不同脅迫下在二色補血草莖、葉中的表達(dá)情況。然后將該基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2中，對其進(jìn)行釀酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化;并對重組酵母進(jìn)行不同逆境

2、脅迫，以驗證二色補血草LbGRP基因的抗逆性;為了深入研究LbGRP基因的功能，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LbGRP基因?qū)霟煵莼蚪M中，通過對轉(zhuǎn)基因煙草的鹽堿脅迫試驗，對LbGRP基因進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗證。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　(1)克隆了二色補血草LbGRP基因的全長cDNA序列，并研究了該基因在不同脅迫下在二色補血草根、葉中的表達(dá)情況。用實時定量RT-PCR方法檢測該基因?qū)Φ蜏?、NaCl、KCl、NaHCO3、Na2C

3、O3和聚二乙醇(PEG)脅迫的基因表達(dá)模式的結(jié)果表明，低溫能誘導(dǎo)LbGRP基因在二色補血草根和葉中表達(dá)，而在NaCl脅迫下，LbGRP基因在二色補血草根和葉中表達(dá)均受抑制。
　　(2)將LbGRP基因與酵母表達(dá)載體pYES2連接，獲得了pYES2-LbGRP重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到釀酒酵母INVSc1菌株中，獲得重組酵母INVSc1（pYES2-LbGRP）。對INVSc1（pYES2-LbGRP）和對照菌株進(jìn)行半乳糖誘導(dǎo)，以研究外

4、源基因LbGRP在酵母中的的表達(dá)情況;Northern雜交結(jié)果表明，INVSc1（pYES2-LbGRP）重組酵母經(jīng)誘導(dǎo)后能夠表達(dá)外源LbLbGRP基因。
　　(3)對重組酵母INVSc1（pYES2-LbGRP)進(jìn)行了NaCl、KCl、Na2CO3、NaHCO3、PEG和低溫脅迫處理，處理結(jié)果證實INVSc1（pYES2-LbGRP）酵母的抗逆性明顯高于對照INVSc1(pYES2)菌株;初步認(rèn)為重組酵母處于逆境脅迫時，通過Lb

5、GRP基因的表達(dá)，增強了酵母對逆境的耐受能力。
　　(4)采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法對煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得20株卡那霉素抗性芽，對其中9株進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果9株全部為陽性轉(zhuǎn)基因植株;進(jìn)一步進(jìn)行Northern雜交檢測，結(jié)果表明外源基因能夠在煙草中表達(dá)。
　　(5)對5個轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了NaCl脅迫處理，分析了逆境脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏谋?MDA)含量、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)

6、活性、過氧化氫酶(CAT)活性、脯氨酸含量和可溶性蛋白等指標(biāo)的變化。結(jié)果表明:NaCl脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系的POD活性、SOD活性、CAT活性、可溶性蛋白含量均較非轉(zhuǎn)基因植物有所提高，5個株系中B14株系表現(xiàn)更佳。
　　綜合以上結(jié)果，LbGRP基因的表達(dá)能夠不同程度提高轉(zhuǎn)基因煙草逆境脅迫下的耐受能力，證實LbGRP基因具有提高植物耐鹽性的功能;同時綜合各個轉(zhuǎn)基因株系幾項生理指標(biāo)的變化，認(rèn)為轉(zhuǎn)基因株系14號對鹽堿脅迫的抗性更強，是