二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌及發(fā)酵產(chǎn)物生物活性研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌是指共生或寄生在宿主植物各組織和器官內(nèi)，不會(huì)引起宿主發(fā)生明顯病變并完成整個(gè)生活周期的一大類微生物。由于長(zhǎng)期與宿主共存，會(huì)產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物，已成為新藥篩選的重要來(lái)源。本次實(shí)驗(yàn)選用二色補(bǔ)血草為植物材料，通過(guò)對(duì)其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物活性的篩選研究，為二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌資源的綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。
　　采用組織塊分離法，從二色補(bǔ)血草全株共分離到內(nèi)生真菌32株。其中葉部6株，莖部11株，根部15株。

2、通過(guò)菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征鑒定，初步鑒定出其中21株，分屬2綱3目7科11屬。以PD培養(yǎng)基將真菌進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵物固液分離，發(fā)酵液依次以乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物（EAE）及正丁醇萃取物（NBE），菌絲體經(jīng)甲醇提取得甲醇提取物（MME），96個(gè)發(fā)酵產(chǎn)物樣品進(jìn)行生物活性篩選研究。
　　抗氧化活性研究結(jié)果顯示，74個(gè)樣品表現(xiàn)出一定的總還原能力，占樣品總數(shù)的77.08%,Vc當(dāng)量超過(guò)100μg/mg共1個(gè),S102（

3、NBE）總還原力最強(qiáng)，VC當(dāng)量為108.20μg/mg；DPPH自由基清除活性研究結(jié)果顯示，94個(gè)樣品表現(xiàn)出DPPH自由基清除活性，占樣品總數(shù)的97.92%，清除率80%以上的共5個(gè)，R301（EAE）活性最強(qiáng)，清除率為94.23%；88個(gè)樣品表現(xiàn)出羥基自由基清除活性，占樣品總數(shù)的91.67%，清除率20%以上的共7個(gè)，R201（NBE）活性最強(qiáng)，清除率為35.34%。
　　抑菌活性研究結(jié)果表明，75個(gè)樣品對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出抑制活性

4、，占樣品總數(shù)的78.13%，抑菌圈直徑在16mm以上的共4個(gè)樣品，S101（NBE）對(duì)其抑制活性最強(qiáng)，MIC為0.625mg/mL；77個(gè)樣品對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抑制活性，占樣品總數(shù)的80.21%，抑菌圈直徑在16mm以上的共2個(gè)樣品，R403（EAE）對(duì)其抑制活性最強(qiáng)，MIC為1.250mg/mL；62個(gè)樣品對(duì)肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出抑制活性，占樣品總數(shù)的64.58%，抑菌圈直徑在16mm以上的共6個(gè)樣品，L301（EAE）對(duì)其抑制活性最

5、強(qiáng)，MIC為0.625mg/mL；54個(gè)樣品對(duì)地衣芽孢桿菌表現(xiàn)出抑制活性，占樣品總數(shù)的56.25%，抑菌圈直徑在16mm以上的共3個(gè)樣品，R401（EAE）對(duì)其抑制活性最強(qiáng)，MIC為0.156mg/mL；55個(gè)樣品對(duì)綠膿桿菌表現(xiàn)出抑制活性，占樣品總數(shù)的57.29%，但整體抑制活性較弱，未達(dá)到復(fù)篩的標(biāo)準(zhǔn)。
　　ɑ-糖苷酶抑制活性研究結(jié)果表明，84個(gè)樣品對(duì)α-糖苷酶表現(xiàn)出抑制活性，占樣品總數(shù)的87.50%，其中抑制率在80%以上的共1

6、1個(gè)，占樣品總數(shù)的11.46%，S303（EAE）抑制活性最高，抑制率為96.38%。
　　抗蟲活性研究結(jié)果表明，8個(gè)樣品對(duì)赤擬谷盜表現(xiàn)出一定的觸殺活性，占樣品總數(shù)的8.33%，其中R302（NBE）活性最強(qiáng)，LC50值為24.268mg/mL（陽(yáng)性對(duì)照藥物氰戊菊酯LC50=0.279mg/mL）；10個(gè)樣品對(duì)煙草甲表現(xiàn)出一定的觸殺活性，占樣品總數(shù)的10.41%，其中S303（NBE）活性最強(qiáng)，LC50值為14.831mg/mL（

7、陽(yáng)性對(duì)照藥物氰戊菊酯LC50=0.140mg/mL)。內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物熏蒸活性整體較弱，5個(gè)樣品表現(xiàn)出熏蒸活性，占樣品總數(shù)的5.01%，其中S303（EAE）對(duì)赤擬谷盜熏蒸活性最強(qiáng)，LC50為29.304mg/mL（陽(yáng)性藥物敵敵畏LC50=0.023mg/mL）；L301(EAE）對(duì)煙草甲熏蒸活性最強(qiáng)，LC50為43.414mg/mL（陽(yáng)性藥物敵敵畏LC50=0.141mg/ml）。驅(qū)避活性研究結(jié)果顯示，5個(gè)樣品對(duì)赤擬谷盜表現(xiàn)出較強(qiáng)的驅(qū)

8、避活性，占樣品總數(shù)的5.21%；6個(gè)樣品對(duì)煙草甲表現(xiàn)出較強(qiáng)的驅(qū)避活性，占樣品總數(shù)的6.25%,其中R304（NBE）對(duì)兩種試蟲的驅(qū)避活性都較強(qiáng)，在10000ppm，作用2h，驅(qū)避率分別為94%、84%，驅(qū)避活性等同于同等條件下的陽(yáng)性物質(zhì)DEET。
　　二色補(bǔ)血草內(nèi)生真菌多糖的提取及抗氧化活性研究結(jié)果顯示，32株內(nèi)生真菌胞內(nèi)及胞外64個(gè)多糖樣品含量各異，其中多糖含量在0.5mg/mL以上的共10個(gè)樣品，占樣品總數(shù)的10.42%，R2

9、02胞外多糖含量最高為0.91mg/mL。多糖抗氧化研究結(jié)果表明，58個(gè)樣品表現(xiàn)出一定的總還原能力，占樣品總數(shù)的90.63%；55個(gè)樣品表現(xiàn)出DPPH清除活性，占樣品總數(shù)的85.94%；54個(gè)樣品表現(xiàn)出羥基自由基清除活性，占樣品總數(shù)的84.37%。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)二色補(bǔ)血草全株進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離，闡明了其內(nèi)生真菌的種類及種屬分布情況，并對(duì)其內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抑菌、抗氧化、α-糖苷酶抑制、抗蟲的活性篩選研究，獲得高活性菌株，為尋找新