唐古特瑞香、鬼臼、淫羊藿內(nèi)生真菌的分離純化及發(fā)酵產(chǎn)物活性研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌與宿主植物長期互惠共生，能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的化學(xué)成分。它們在植物內(nèi)廣泛存在，并且表現(xiàn)出豐富的物種和代謝產(chǎn)物多樣性，可以認(rèn)為是在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景和潛力的化合物庫。鑒于此，本文選擇唐古特瑞香（Daphne tangutica Maxi.）、鬼臼（Sinopodophyllum hexandrum(Royle) Ying）、淫羊藿（Epimedium brevicornum Maxim.）三種藥用植物作為

2、材料，對(duì)其內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行研究。
　　采用組織塊分離法，從唐古特瑞香、鬼臼、淫羊藿的莖部分離得到30株內(nèi)生真菌，這些菌株菌落形態(tài)多樣，生長特點(diǎn)各有不同。通過菌落形態(tài)觀察和顯微觀察，并對(duì)照《真菌鑒定手冊》，共鑒定出其中的9株。9株內(nèi)生真菌分屬于短梗梭孢霉屬（Fusoma）、交鏈孢霉屬（Alternaria）、單端孢霉屬（Didymopsis）、梨形孢屬（Piricularia）、頭孢霉屬（Cephalosporiu

3、m）、串珠霉屬（Moniliara）、曲霉屬（Aspergillus）和鐮刀菌屬（Fusarium）。
　　對(duì)從唐古特瑞香、鬼臼、淫羊藿三種藥用植物的莖部分離得到的共計(jì)30株內(nèi)生真菌進(jìn)行了發(fā)酵并對(duì)發(fā)酵物進(jìn)行了處理，得到其發(fā)酵液乙酸乙酯、正丁醇萃取物及菌絲體甲醇提取物共計(jì)90個(gè)樣品，對(duì)90個(gè)樣品的抑菌、抗氧化和α-糖苷酶抑制活性進(jìn)行了篩選研究。
　　抑菌實(shí)驗(yàn)采用濾紙片法。結(jié)果表明：RX-S-102菌株的乙酸乙酯萃取物在濃度為1

4、0 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌（S. au）、地衣芽孢桿菌（B. lic）、大腸桿菌（E. coli）、綠膿桿菌（P. ae）和肺炎克雷伯菌（K. pn）五種指示菌均表現(xiàn)出很強(qiáng)（22mm<抑菌圈直徑≤28mm）的抑制活性，抑菌圈直徑范圍達(dá)到22.3~28.0mm，進(jìn)一步最小抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果顯示其對(duì)上述五種指示菌的最小抑菌濃度范圍為0.025~0.100 mg/mL；同時(shí)，RX-S-105菌株乙酸乙酯萃取物對(duì)地衣芽孢桿菌（B

5、. lic）和肺炎克雷伯菌（K. pn）兩種指示菌、GJ-S-208菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌（S. au）、GJ-S-203菌株菌絲體甲醇提取物對(duì)地衣芽孢桿菌（B. lic）、YYH-S-301菌株正丁醇萃取物對(duì)大腸桿菌（E. coli）均表現(xiàn)出強(qiáng)（16mm<抑菌圈直徑≤22mm）的抑制活性；此外，在全部90個(gè)樣品中，僅RX-S-106菌株發(fā)酵液正丁醇萃取物對(duì)全部5種指示菌均未顯示出明顯的抑制活性。
　　抗氧化實(shí)驗(yàn)

6、分別采用鐵氰化鉀還原法、水楊酸法和DPPH自由基清除法（樣品濃度均為0.1 mg/mL）。結(jié)果表明：在總還原力的測定中，樣品中維生素C相當(dāng)含量（Vc當(dāng)量）超過300μg/mg的有6個(gè)，其中RX-S-104、GJ-S-203和YYH-S-304菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物的Vc當(dāng)量分別達(dá)到973.39μg/mg、735.08μg/mg和710.39μg/mg，Vc及上述三個(gè)樣品進(jìn)一步EC50值測定結(jié)果分別為0.1164 mg/mL、0.126

7、6 mg/mL、0.1732 mg/mL、0.1796 mg/mL；樣品對(duì)羥自由基清除率均未超過50%，且未發(fā)現(xiàn)有在相同濃度下對(duì)羥基自由基的清除率超過Vc的樣品，相同濃度下Vc對(duì)羥基自由基的清除率為46.83%；12個(gè)樣品的DPPH自由基清除率大于80%，其中，GJ-S-208菌絲體甲醇提取物和GJ-S-209菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對(duì)DPPH自由基的清除率分別為92.79%和90.26%，Vc及上述兩個(gè)樣品進(jìn)一步IC50測定結(jié)果分別為

8、0.0054 mg/mL、0.0541 mg/mL、0.0563 mg/mL。
　　α-糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn)采用改良后的 PNPG法（樣品濃度均為1 mg/mL）。結(jié)果表明：90個(gè)樣品對(duì)α-糖苷酶均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，抑制率超過80%的樣品共有35個(gè)，其中，對(duì)α-糖苷酶抑制率超過90%的樣品共有7個(gè)；相同濃度下，拜糖平對(duì)α-糖苷酶的抑制率為99.71%。
　　進(jìn)一步對(duì)高活性菌株RX-S-102進(jìn)行大量發(fā)酵并采用硅膠柱色譜