植物內(nèi)生菌A11抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件及其分離純化的研究.pdf

1、世界上由于癌癥、耐藥細(xì)菌、真菌等引發(fā)的疾病越來越多，尤其是艾滋病和器官移植導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)能力下降，隨之帶來真菌感染機(jī)率的增加，使得人們對抗生素的需求也不斷地增加。另外，隨著抗生素的廣泛使用，耐藥性問題已經(jīng)不可忽視，尋找新的抗生素是解決這一問題的方法之一。過去，抗生素大多來源于土壤微生物，近年來，植物內(nèi)生菌因?yàn)槠浞N類繁多、開發(fā)較少，而逐漸受到人們的關(guān)注。另外，不斷有研究者發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)不但種類繁多，而且有許多是未開發(fā)的新物

2、質(zhì)。因此，植物內(nèi)生菌因具有作為新型藥物來源的巨大潛力而備受關(guān)注。但現(xiàn)階段對植物抗菌內(nèi)生菌的研究剛剛開始，對其特性了解還不夠深入而無法對其充分利用，因此，對植物抗菌內(nèi)生菌的研究不僅能帶來巨大的社會效益還具有現(xiàn)實(shí)的理論意義。本實(shí)驗(yàn)室從中華蘆薈葉中分離到了一株具有廣譜抗菌活性的內(nèi)生細(xì)菌A11，并對該菌株及其活性物質(zhì)進(jìn)行了前期的研究，在前期研究的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對植物內(nèi)生菌A11進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，以求增加抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的同時減少發(fā)酵液的

3、黏度，并對A11所產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化技術(shù)的研究，為其后的物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定打下基礎(chǔ)，試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.植物內(nèi)生細(xì)菌A11抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化為了在增加植物內(nèi)生細(xì)菌A11發(fā)酵活性物質(zhì)產(chǎn)量的同時減少發(fā)酵液粘度，對植物內(nèi)生細(xì)菌A11進(jìn)行了裝液量、接種量、初始pH值、最適碳源和氮源、甲醇添加劑以及表面活性劑等發(fā)酵條件的研究。結(jié)果表明：通過單因素試驗(yàn)得到增加活性物質(zhì)產(chǎn)量并降低發(fā)酵粘度的最適碳源、氮源及其含量分別為蔗糖0.5﹪

4、、硝酸銨0.25﹪，裝液量30﹪，接種量5﹪，初始pH7.0-8.0，28℃、200r/min發(fā)酵72h。發(fā)酵促進(jìn)劑實(shí)驗(yàn)表明，甲醇既無法作為碳源被A11利用，也對A11產(chǎn)生活性物質(zhì)無任何促進(jìn)作用；而表面活性劑(Tween-80)則對活性物質(zhì)的產(chǎn)生起到了抑制的作用。 2.抗菌活性物質(zhì)的分離純化發(fā)酵液經(jīng)滅菌處理后離心取上清液，依次經(jīng)無水乙醇浸提，正丁醇萃取以及甲醇浸提后，過SephadexG-25分子篩，收集所得活性物質(zhì)通過TLC進(jìn)

5、一步分離，得到的5個斑點(diǎn)中只有一個為活性斑點(diǎn)，其Rf值范圍在0.59-0.64之間的。該種方法只適用于活性物質(zhì)的分析檢驗(yàn)，而不適用于活性物質(zhì)的制備分離純化。 SephadexG-25過柱后直接進(jìn)行HPLC分離純化樣品，紫外掃描測出活性物質(zhì)的波長為261nm，利用分析型HPLC確定洗脫條件，洗脫液配比為乙腈∶水=10∶90，流速0.6mL/min，時間設(shè)定為10min，柱溫25℃。制備型液相色譜以相同的條件進(jìn)行分離純化，分析時間延