斑茅抗逆性評價及其BADH基因的克隆表達(dá).pdf

1、斑茅(Erianthus arundinaceus)是甘蔗的重要近緣屬植物,生長勢強(qiáng)、抗旱、耐瘠、宿根性好,是甘蔗育種的重要基因資源.該研究在系統(tǒng)分析斑茅抗逆性基礎(chǔ)上,通過同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)、Northern雜交、原核表達(dá)等,克隆斑茅BADH基因,并研究其在抗逆方面的分子作用.結(jié)果如下:用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了斑茅甜菜堿醛脫氫酶基因.斑茅BADHcDNA全長1718bp,5'端290bp左右片段GC含量高達(dá)75.9％,包

2、含一個1515 bp的開放讀碼框,5'端非編碼區(qū)35bp,3'端非編碼區(qū)165bp,理論分子量為54.905kDa,其推演氨基酸含有十肽VTLELGGKSP和一個與酶功能有關(guān)的Cys為醛脫氫酶高度保守的序列,以及C-端信號肽SKL.將斑茅BADH編碼區(qū)1515bp核苷酸序列在GenBank中進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)其與Zeamays PCO110216的已知部分序列同源性為97％;與S.bicolorBADHl部分序列同源性為95％;與O.sat

3、iva BADH、H.vulgare BBB2和T.aestivum BADH的5'端無同源性.分子進(jìn)化分析表明,22個BADH基因由同一基因進(jìn)化成五個類群,雙子葉植物進(jìn)化變異較大;所有已知禾本科植物斑茅、高粱、玉米、大麥、小麥的BADH基因為一簇,其中按同工酶類型分為兩組;斑茅與高粱的同源性高于斑茅與玉米,以及高粱與玉米的同源性.包含醛保守序列的斑茅BADH部分cDNA序列作探針,進(jìn)行Southem和Northern雜交分析.結(jié)果表明

4、,斑茅BADH在基因組中有一到兩個拷貝;斑茅BADH為誘導(dǎo)型表達(dá)基因,干旱脅迫,表達(dá)量增加,復(fù)水后其表達(dá)量減少;鹽脅迫時,表達(dá)量隨著脅迫時間增加,然后保持某一水平,但又受環(huán)境溫度影響;鹽脅迫10天時,根中甜菜堿醛脫氫酶的表達(dá)量大于莖中的,莖中的大于葉中.構(gòu)建斑茅甜菜堿醛脫氫酶的原核表達(dá)載體,原核表達(dá)斑茅甜菜堿醛脫氫酶基因,在酶粗提液中檢測到酶的比活力為9.04 nmolmin<'-1> mg<'-1>蛋白.斑茅BADH基因的成功分離并轉(zhuǎn)