斑皮桉及其近緣樹種CCR基因分子克隆及變異分析.pdf

1、桂酰輔酶A還原酶基因(CCR)控制木質(zhì)素含量和組成，而且與桉屬木材強(qiáng)度特性有密切關(guān)聯(lián)，因此CCR與造紙和實(shí)木利用緊密相關(guān)．傘房屬(Corymbia)，包括紅木桉(Bloodwoods)和鬼膠桉(Ghost gums)，曾經(jīng)被認(rèn)為是桉屬中的一個(gè)亞屬，已被確認(rèn)為獨(dú)立的一個(gè)屬，因此，現(xiàn)在桉樹包括桉屬(Eucalyptus)、杯果木屬(Angophora)和傘房屬3個(gè)屬．斑皮桉群體(傘房屬中的Politaria組)被認(rèn)為是林業(yè)中最重要一類．本試

2、驗(yàn)共選擇有代表性的Politaria，Rufaria，Ocharia，Blakearia和Cadagaria 5個(gè)組，共20個(gè)樹種進(jìn)行測(cè)序，桉屬加檸桉(Eucalyptus gunnii)或杯果木屬做為外屬，進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系的研究和分析． 試驗(yàn)使用Qiagen產(chǎn)品的DNeasy<'TM> 96 Plant Kit試劑盒，加入PVP以防止酚類對(duì)酶活性的抑制作用，這是一種高效DNA提取方法．首先借助E gunnii CCR基因，然后

3、根據(jù)獲得的樣本7782 CCR序列進(jìn)行設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增傘房屬CCR基因．對(duì)PCR條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出特異引物對(duì)CCR_0420F和CCR_1678R，CCR_1610F(自行設(shè)計(jì))和CCR 3198R、CCR AF(自行設(shè)計(jì))和CCR-3198R，以及CCR_BF(自行設(shè)計(jì))和CCR_ER(自行設(shè)計(jì))．從瓊脂糖凝膠切下目的片段進(jìn)行純化并直接測(cè)序或克隆后測(cè)序．對(duì)測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行改進(jìn)以至能獲得長(zhǎng)達(dá)1 kb的單個(gè)片段序列．改進(jìn)的測(cè)序反應(yīng)純化為：在12

4、μl測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物中加入40μl去離子水、5μl 3 M乙酸鈉、125μl分析純乙醇，省略了EDTA． 首先用軟件Sequencher 4.5對(duì)16個(gè)CCR基因進(jìn)行校正和拼接，用ClustalW自動(dòng)對(duì)比并加以手工操作．這16個(gè)CCR基因序列與GenBank發(fā)表的其它植物CCR基因進(jìn)行BLAST比較，發(fā)現(xiàn)與20種植物CCR基因有很高相似性，最高達(dá)97％，為同源序列． 本研究用軟件MEGA 3.1對(duì)傘房屬20個(gè)樹種或個(gè)體CCR

5、序列差異區(qū)域和分布做了分析，尤其是斑皮桉(8個(gè))(傘房屬Politaria組)以及后來(lái)克隆的4個(gè)CCV個(gè)體．而傘房屬其它4個(gè)組：Rufaria，Blakearia，Ochraria和Cadagaria也進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)傘房屬各組潛在的基因座進(jìn)行研究以構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹． 用基因做系統(tǒng)進(jìn)化分析在國(guó)外已經(jīng)普遍存在．以加檸桉為外屬或不以加檸桉為外屬構(gòu)建的進(jìn)化樹，傘房屬各組形成單系，親緣關(guān)系可以明顯區(qū)分開來(lái)，但以沒外屬的更加合理．2種進(jìn)化樹種

6、間進(jìn)化關(guān)系不容易區(qū)分，這種關(guān)系可能與基因進(jìn)化速度、堿基替代、插入/缺失、SSR、基因內(nèi)重組等有關(guān)系．雖然杯果木屬CCR與傘房屬親緣關(guān)系比較接近，但用杯果木屬為外屬構(gòu)建的進(jìn)化樹，有4個(gè)組形成多系，進(jìn)化關(guān)系不容易區(qū)分． 試驗(yàn)分析得到傘房屬變異位點(diǎn)292個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)171個(gè)；Polotaria組變異位點(diǎn)65個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)38個(gè)；CCV變異位點(diǎn)37個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)9個(gè)．內(nèi)含子變化位點(diǎn)比外顯子多，尤其是內(nèi)含子4變化位點(diǎn)多

7、．這些位點(diǎn)能為斑皮桉群體及其近緣樹種木材特性提供相關(guān)的分子信息．這些位點(diǎn)最有可能與木材微纖角(mfa)以及木質(zhì)素組成(S/G)和含量有關(guān)．為今后斑皮桉尤其是CCV與木材特性的關(guān)聯(lián)研究提供基礎(chǔ)遺傳數(shù)據(jù)． 對(duì)CCV樣本7790 CCR基因克隆測(cè)序后證實(shí)，7790是個(gè)多拷貝．分析表明：7790 CCV可能有3個(gè)拷貝．在國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)傘房屬部分樹種CCR具有多拷貝，而桉屬CCR只有單拷貝，本試驗(yàn)所得杯果木屬CCR也只有單拷貝．