囊泡運(yùn)輸在二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽中的作用研究.pdf

1、全球土壤鹽漬化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，鹽漬化土壤正向耕地蔓延，經(jīng)濟(jì)發(fā)展、糧食和能源安全正面臨著嚴(yán)峻威脅。鹽堿地廣泛分布的泌鹽鹽生植物具有典型的泌鹽結(jié)構(gòu)鹽腺和鹽囊泡，是區(qū)別于其他鹽生植物和所有非鹽生植物唯一可見(jiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。鹽腺是泌鹽鹽生植物最重要的離子排出器官，主要分布在植物的莖、葉表面等地上部分，其功能是把植物體內(nèi)過(guò)多的鹽分分泌到體外。因此，鹽腺在調(diào)節(jié)泌鹽鹽生植物體內(nèi)的離子平衡，維持滲透壓穩(wěn)定及提高植物的耐鹽性等方面發(fā)揮重要作用。所以，研究鹽腺泌

2、鹽機(jī)制對(duì)于揭示泌鹽鹽生植物耐鹽機(jī)理和培育耐鹽農(nóng)作物都有非常重要的意義。目前，對(duì)鹽腺泌鹽機(jī)制的研究大多還停留在解剖學(xué)和生理學(xué)水平，鹽腺發(fā)育及泌鹽的分子機(jī)理的研究相對(duì)滯后。如果能夠揭示泌鹽鹽生植物鹽腺泌鹽的分子機(jī)理，克隆關(guān)鍵基因并最終培育具有泌鹽能力的農(nóng)作物對(duì)于開(kāi)發(fā)和利用鹽堿地生產(chǎn)糧食具有重大意義。
　　二色補(bǔ)血草是一種典型的泌鹽鹽生植物，具有多細(xì)胞鹽腺，多分布于鹽堿地和濱海灘涂，在改造鹽堿地和培育耐鹽植物方面具有重要的研究?jī)r(jià)值，被譽(yù)

3、為改造鹽堿地的“先鋒植物”，是研究雙子葉植物鹽腺的理想材料。因此，研究二色補(bǔ)血草鹽腺的泌鹽特征和分子機(jī)理具有重要意義。
　　本論文對(duì)二色補(bǔ)血草鹽腺超微結(jié)構(gòu)、泌鹽特征和分子機(jī)理進(jìn)行了探究，主要結(jié)果如下：
　　1.研究了二色補(bǔ)血草鹽腺細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征
　　以二色補(bǔ)血草葉片為材料，使用高壓冷凍、冷凍替代、超薄切片和細(xì)胞核DAPI染色技術(shù)等，利用透射電子顯微鏡觀察二色補(bǔ)血草鹽腺的超微結(jié)構(gòu)，為研究鹽腺的泌鹽機(jī)制奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

4、二色補(bǔ)血草鹽腺由16個(gè)細(xì)胞組成，中央為4個(gè)長(zhǎng)的分泌細(xì)胞，每個(gè)分泌細(xì)胞外側(cè)均伴有1個(gè)長(zhǎng)方形的短的毗鄰細(xì)胞，再向外依次包圍著4個(gè)內(nèi)杯狀細(xì)胞和4個(gè)外杯狀細(xì)胞，鄰近的細(xì)胞稱為收集細(xì)胞；細(xì)胞核較大，富含線粒體、高爾基體和小囊泡，但缺少中央大液泡，也沒(méi)有葉綠體；細(xì)胞之間通過(guò)胞間連絲進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸與信息傳遞，可以把吸收到植物體內(nèi)過(guò)多的鹽分運(yùn)輸?shù)椒置诩?xì)胞，然后排出體外，最大程度的避免了鹽分對(duì)植物體產(chǎn)生的傷害；鹽腺被角質(zhì)層包圍，角質(zhì)層中存在分泌孔，植物體吸

5、收的多余的鹽分進(jìn)入鹽腺后運(yùn)輸?shù)椒置诩?xì)胞和角質(zhì)層之間形成的大的收集室內(nèi)，最后通過(guò)收集室上方的角質(zhì)層上的分泌孔排出體外；可觀察到鹽腺分泌細(xì)胞中小囊泡與細(xì)胞質(zhì)膜的融合，說(shuō)明鹽腺細(xì)胞中有類似于胞飲的相反過(guò)程的現(xiàn)象發(fā)生；也可看到分泌細(xì)胞中多個(gè)小囊泡間的相互融合，多個(gè)小囊泡可以融合為大的囊泡，表明鹽腺細(xì)胞中的小囊泡可能參與鹽腺的離子分泌過(guò)程。
　　2.創(chuàng)建了葉圓盤分泌模型用于測(cè)定二色補(bǔ)血草葉片單個(gè)鹽腺的泌鹽速率
　　利用打孔器將二色補(bǔ)血

6、草葉片打孔成10 mm直徑的葉圓盤，將葉圓盤下表皮向上，浸泡在含有不同濃度NaCl溶液的培養(yǎng)皿中，并在葉圓盤上滴加一層礦物油，這樣既可以避免蒸騰作用帶來(lái)的干擾，又可以將葉圓盤鹽腺分泌出來(lái)的流體束縛于礦物油中，然后用微量移液器把鹽腺分泌的流體吸出，這樣可以特異地測(cè)定鹽腺分泌的流體體積、離子分泌速率以及分泌物的離子組成等參數(shù)。二色補(bǔ)血草葉圓盤分泌模型不僅可用來(lái)研究不同濃度 NaCl處理下鹽腺的離子分泌特征，也可作為篩選泌鹽突變體(單個(gè)鹽腺的

7、泌鹽速率顯著下降或增加的二色補(bǔ)血草突變體)的一種簡(jiǎn)便快捷的方法。
　　3.探究了二色補(bǔ)血草鹽腺的離子分泌途徑和特點(diǎn)
　　掃描電鏡得到的圖片顯示鹽腺的每個(gè)分泌細(xì)胞在角質(zhì)層中含有一個(gè)分泌孔，并且可以看到葉片表面的分泌物位于分泌孔的上方；環(huán)境掃描電子顯微鏡的結(jié)果證實(shí)了分泌物的元素構(gòu)成主要是Na和Cl；非損傷微測(cè)技術(shù)用來(lái)直接測(cè)定單個(gè)鹽腺的單一離子的分泌速率，200 mmol/L NaCl處理顯著提高了鹽腺的Na+和Cl-分泌速率；然

8、而，表皮細(xì)胞和氣孔僅分泌極少量的離子?？傻贸鼋Y(jié)論：二色補(bǔ)血草鹽腺細(xì)胞含有4個(gè)分泌孔，鹽處理下NaCl通過(guò)這些分泌孔排出體外。
　　4.發(fā)現(xiàn)了鹽腺細(xì)胞內(nèi)K+的積累在二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽過(guò)程中起重要作用
　　利用高壓冷凍和冷凍替代技術(shù)結(jié)合納米離子探針?lè)治黾夹g(shù)在亞細(xì)胞水平上研究了二色補(bǔ)血草鹽腺細(xì)胞中K和Na元素的原位分布并成像。較高濃度的Na+分布在鹽腺細(xì)胞的質(zhì)外體。與對(duì)照組(0 mmol/L NaCl)相比，200 mmol/L

9、NaCl處理導(dǎo)致鹽腺細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)K+和Na+濃度的增加，盡管NaCl處理引起細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)K+/Na+比的小幅下降。然而，NaCl處理卻導(dǎo)致幼苗葉片中K+濃度和K+/Na+比的顯著下降。此外，200 mmol/L NaCl處理下單個(gè)鹽腺的Na+分泌速率是對(duì)照組的5倍。這些結(jié)果表明，鹽處理下鹽腺細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)K+的積累可能在二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽過(guò)程中起重要作用。
　　5.確定了囊泡運(yùn)輸參與二色補(bǔ)血草鹽腺的泌鹽過(guò)程并

10、克隆了關(guān)鍵基因的片段
　　用囊泡化抑制劑 BFA處理二色補(bǔ)血草葉片，首先用葉圓盤法測(cè)定鹽腺的泌鹽速率是否受到影響；然后用非損傷微測(cè)技術(shù)對(duì)單個(gè)鹽腺分泌的Na+的速率進(jìn)行直接精確的測(cè)量；最后用透射電子顯微鏡觀察鹽腺組成細(xì)胞內(nèi)高爾基體的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化。結(jié)果表明，BFA顯著抑制鹽腺泌鹽且鹽腺細(xì)胞內(nèi)高爾基體解體，因此，推測(cè)囊泡運(yùn)輸參與二色補(bǔ)血草鹽腺的泌鹽過(guò)程。根據(jù)高通量測(cè)序篩選得到了5個(gè)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因并克隆了這些基因的片段，并用RT-P

11、CR技術(shù)分析了這5個(gè)基因在不同濃度NaCl處理下的表達(dá)量，利用分子技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了囊泡運(yùn)輸在鹽腺泌鹽過(guò)程中的作用，為全面闡明鹽腺泌鹽機(jī)制打下了基礎(chǔ)。
　　6.篩選了二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽突變體
　　利用離子注入誘變和60Co gamma射線輻射誘變探索適合二色補(bǔ)血草種子的最佳誘變方法，篩選得到了32株鹽腺泌鹽突變體，其中篩選得到了15株單個(gè)鹽腺泌鹽增加的突變體和17株單個(gè)鹽腺泌鹽減少的突變體，為探討囊泡運(yùn)輸在二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽中

12、的作用和泌鹽關(guān)鍵基因的功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。
　　本論文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):
　　1.利用高壓冷凍、冷凍替代和細(xì)胞核DAPI染色技術(shù)，用透射電鏡觀察二色補(bǔ)血草鹽腺細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)鹽處理后鹽腺細(xì)胞形成大量小囊泡且有的與質(zhì)膜融合，表明囊泡化可能參與鹽腺泌鹽過(guò)程，為研究囊泡化參與鹽腺的泌鹽機(jī)制奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　2.利用掃描電鏡和環(huán)境掃描電子顯微鏡探究鹽腺的泌鹽途徑和特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)鹽腺細(xì)胞含有4個(gè)分泌孔，鹽處理下NaCl通過(guò)這些分泌

13、孔排出體外。
　　3.利用納米離子探針?lè)治黾夹g(shù)，發(fā)現(xiàn)鹽處理下鹽腺組成細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)K+的積累可能在二色補(bǔ)血草鹽腺泌鹽過(guò)程中起重要作用。
　　4.用囊泡化抑制劑BFA處理二色補(bǔ)血草葉片，發(fā)現(xiàn)BFA顯著抑制鹽腺泌鹽且鹽腺細(xì)胞內(nèi)高爾基體解體，因此推測(cè)囊泡運(yùn)輸參與二色補(bǔ)血草鹽腺的泌鹽過(guò)程?？寺×烁鶕?jù)高通量測(cè)序篩選得到的5個(gè)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的片段，并用熒光定量PCR技術(shù)分析了這5個(gè)基因在不同濃度NaCl處理下的表達(dá)量，其中三個(gè)