二色補血草鹽腺離子分泌特征及相關功能基因的研究.pdf

1、鹽腺是泌鹽鹽生植物中最重要的離子排出器官，這種結構主要分布在植物的葉表面等地上部分器官，在調節(jié)體內離子平衡、維持滲透壓穩(wěn)定及提高泌鹽鹽生植物的耐鹽性等方面發(fā)揮重要作用。目前，對植物鹽腺的泌鹽機理研究大多還停留在解剖學和生理學研究水平，鹽腺發(fā)育及泌鹽的分子機理研究相對滯后。如果能夠揭示植物鹽腺的發(fā)育和分泌的分子機制，克隆關鍵基因并最終培育具有泌鹽能力的作物，對于開發(fā)利用鹽堿地具有重大意義。
　　二色補血草是一種典型的泌鹽鹽生植物，具

2、有多細胞鹽腺結構，是研究雙子葉植物鹽腺的理想材料。因此，研究二色補血草鹽腺的泌鹽特征和分子機理具有重要意義。
　　本研究創(chuàng)建并優(yōu)化多種實驗方法應用于二色補血草鹽腺泌鹽機理的研究。首先，利用熒光顯微鏡發(fā)現，二色補血草鹽腺細胞團的外壁層在330～380 nm的紫外光激發(fā)下具有獨特的自發(fā)熒光現象，可以作為研究鹽腺分布、形態(tài)及突變體篩選的簡便、可靠手段；其次，本研究優(yōu)化建立了一套不受外界干擾、利用一個葉片即可測定不同處理下鹽腺離子分泌的二

3、色補血草葉圓盤分泌模型，適用于二色補血草鹽腺分泌特征分析，葉圓盤的參數為：葉圓盤直徑12 mm，溶液離子濃度100～300 mmol L-1，分泌時間24 h，分泌溫度20～25℃，光照條件12 h光照+12 h黑暗（光照強度1000μmol m-2 s-1），溶液酸堿度pH=5～6.5；第三，本研究初步獲得了二色補血草鹽腺酶解分離方案：酶解液（0.1％果膠酶Y-23，1%崩潰酶，1%纖維素酶，pH=5.7），抽真空10分鐘，30℃黑暗

4、，30 rpm酶解，將酶解得到的大塊碎渣輕柔研磨，然后利用100μm、70μm和40μm濾器依次過濾，將鹽腺用20μm濾膜收集，為進一步研究不同鹽腺細胞表達譜等奠定了基礎；第四，本研究成功的將由TRV病毒誘導的植物基因瞬時沉默技術（VIGS）移植到二色補血草鹽腺泌鹽研究中，篩選出最佳的條件為：8周齡幼苗，侵染農桿菌濃度為OD600=0.8，侵染檢測期為侵染6天。
　　本研究利用離子色譜技術探索二色補血草葉片及鹽腺離子分泌特征，采用

5、不同鹽溶液處理，對二色補血草內部和鹽腺分泌的離子進行檢測，力求獲得二色補血草離子分泌的種類、選擇性和離子之間彼此作用的特征。結果表明，二色補血草鹽腺具有施加某種離子增強分泌某種離子的特點，分泌的陽離子主要包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+和NH4+，分泌的陰離子主要包括Cl-、NO3-、SO42-、Br-、PO33-、NO2-、草酸根、甲酸根、乙酸根與檸檬酸根；二色補血草葉片內部主要檢測出的陽離子為Na+、K+、Ca2+、Mg2+以及

6、NH4+，陰離子為甲酸根、乙酸根、草酸根、檸檬酸根、SO42-、Cl-、NO3-和NO2-，二色補血草對一價堿土陽離子和鹵素陰離子具有優(yōu)先吸收和外排能力；在不同鹽溶液處理下，二色補血草的Na+/K+維持在2.5以下，且K+沒有大量通過鹽腺分泌流失，說明二色補血草的耐鹽機制主要是通過鹽腺把吸收的過多離子分泌到體外而不是區(qū)域化到液泡中；雖然二色補血草鹽腺具有施加某種離子增強分泌某種離子的特點，但其鹽腺的泌鹽作用具有顯著的離子選擇性：對陽離子

7、分泌選擇性為Na+≥K+>Mg2+>Ca2+>NH4+，對陰離子分泌的選擇為 Cl-≥Br->SO42-=NO3-=NO2-=乙酸根>草酸根=甲酸根>檸檬酸根，并且二色補血草鹽腺分泌的總陰、陽離子電荷基本是等量的；陰離子對二色補血草鹽腺Na+分泌的促進作用為Cl-=Br->NO3-=SO42->檸檬酸根，陽離子對二色補血草鹽腺Cl-分泌的促進結果為Na+≥K+>Ca2+≥Mg2+，一價堿土陽離子和鹵素陰離子在二色補血草鹽腺分泌中彼此促進

8、；NaCl處理可以增加二色補血草葉片汁液中Ca2+濃度，Ca2+對二色補血草Na+分泌具有促進作用，二價陰離子和有機酸根在鹽腺分泌中主要起到平衡電荷的作用。
　　目前對于植物激素和鹽腺分泌之間關系的研究較少，本研究發(fā)現40 mg L-1 GA3處理和60 mg L-1 ABA處理可以明顯的降低二色補血草Na+分泌速率，對于進一步深入研究 GA3和 ABA在二色補血草鹽腺泌鹽過程的作用機理奠定了基礎。
　　針對二色補血草鹽腺的

9、研究發(fā)現，二色補血草鹽腺分泌 Na+受到 Na+/K+ATPase、H+-ATPase、Na+/H+逆向轉運蛋白（SOS1）和Na+:K+:Cl-共轉運體（NKCC抑制劑）furosemide、vanadate、amiloride和 bumetanide的影響。因此我們推測編碼這些跨膜轉運體的基因可能參與二色補血草鹽腺泌鹽過程，利用實時定量PCR技術分析了可能與二色補血草泌鹽相關基因質膜H+-ATPase、NKCC、SOS1和二色補血草

10、ENA同源片段的基因表達與鹽腺Na+分泌之間的關系。結果發(fā)現， H+-ATPase隨外源（0～300 mmol L-1）NaCl處理濃度的升高表達量逐漸增強，與鹽腺Na+分泌速率呈現線性正相關關系(R2=0.99)，在40 mg L-1 GA3處理和60 mg L-1 ABA處理時表達量明顯降低，說明H+-ATPase與激素處理導致Na+分泌速率降低相關；本實驗利用免疫組化技術發(fā)現NKCC定位于鹽腺，在200 mmol L-1 NaCl

11、處理下免疫組化信號增強，同時發(fā)現NKCC抑制劑bumetanide不僅抑制鹽腺Na+的外排也抑制K+的釋放，NKCC的表達量隨外源（0～300 mmol L-1）NaCl處理濃度的升高表達量逐漸增強，與鹽腺 Na+分泌速率呈現正相關關系(R2=0.97)，在40 mg L-1 GA3處理和60 mg L-1 ABA處理中表達量明顯減低，與激素處理Na+分泌速率的變化趨勢相一致。SOS1的表達量隨外源（0～300 mmol L-1）NaC

12、l處理濃度的升高表達量有略微增加的趨勢，說明SOS1在鹽腺分泌中起到一定作用，但是沒有H+-ATPase和NKCC那樣明顯，在40 mg L-1 GA3處理和60 mg L-1 ABA處理中SOS1并沒有體現出與Na+分泌速率相關的規(guī)律性變化，說明SOS1的表達量并沒有通過這兩種激素的路徑調節(jié)；二色補血草ENA同源序列的表達量無論在NaCl處理還是激素處理中，表達量都呈現組成型特征。說明NKCC和H+-ATPase是調控二色補血草Na+

13、分泌的關鍵基因，SOS1和 ENA可能參與了二色補血草的泌鹽過程，但不是調節(jié)Na+分泌的關鍵因子。
　　本實驗成功地利用TRV介導的VIGS方案獲得了三組NKCC基因瞬時沉默的二色補血草葉片，其基因表達量為對照的60.3～75.1%，瞬時NKCC基因沉默的二色補血草葉片鹽腺的Na+分泌速率為空白對照的52%～67.5%，Cl-分泌速率為空白對照的59.1%～68.1%，下降趨勢明顯。這些結果進一步說明NKCC是參與二色補血草鹽腺泌

14、鹽的關鍵基因。
　　以上結果說明NKCC和H+-ATPase是調控二色補血草Na+分泌的關鍵基因， SOS1和ENA可能參與了二色補血草的泌鹽過程，但不是調節(jié)Na+分泌的關鍵因子。
　　為了獲取更多的二色補血草泌鹽相關基因以及探索泌鹽相關基因調控模式，本研究成功建立起二色補血草對照與200 mmol L-1NaCl處理下葉片數字基因差異表達譜，獲得了大量的信息。初步分析表明，200 mmol L-1NaCl處理下葉片許多抗性

15、響應基因（如鹽和低溫響應蛋白）表達都顯著升高，說明這些基因可能參與了諸如泌鹽等耐鹽相關響應。微管組成的基因α-Tubulin表達量也明顯升高，說明了由α-Tubulin表達量增強帶動植物體內微管的變化可能與泌鹽活動的囊泡化轉運相關。此外我們還發(fā)現200 mmol L-1NaCl處理下二色補血草葉片糖類代謝基因和膜脂去飽和相關基因的表達都有升高，從另一方面可以驗證二色補血草葉片鹽腺泌鹽活動為耗能的主動運輸過程及需要位于細胞膜系統(tǒng)的轉運體參

16、與的觀點。這些結果為進一步研究二色補血草鹽腺泌鹽分子機制奠定了基礎。
　　本論文主要創(chuàng)新點：
　　1首次利用離子色譜技術對二色補血草的鹽腺的分泌物進行定性和定量分析，發(fā)現二色補血草對一價堿土陽離子和鹵素陰離子具有優(yōu)先吸收和外排能力且二色補血草鹽腺分泌的總陰、陽離子電荷基本是等量的，并首次在植物鹽腺分泌物中檢測到甲酸根、乙酸根、檸檬酸根以及 NH4+，補充了對植物鹽腺分泌離子種類的認識；
　　2首次驗證了編碼質膜Na+:

17、 K+: Cl-共轉運體和H+-ATPase的基因是調控二色補血草Na+分泌的關鍵基因，SOS1和ENA可能參與了二色補血草的泌鹽過程，但不是調節(jié)Na+分泌的關鍵因子；
　　3首次將基于病毒的植物瞬時基因沉默方案移植到二色補血草鹽腺研究中，并獲得 Na+: K+: Cl-共轉運體瞬時基因沉默植株，基因表達量為對照的60.3%～75.1%。Na+: K+: Cl-共轉運體基因瞬時沉默造成二色補血草鹽腺分泌Na+分泌速率降低為對照的5

18、2%～67.5%和Cl-降低為對照的59.1%～68.1%。表明VIGS是研究鹽腺泌鹽基因的良好工具；
　　4目前對于植物激素對植物鹽腺泌鹽的研究較少，本研究首次發(fā)現赤霉素和脫落酸對二色補血草鹽腺泌鹽及鹽腺發(fā)育具有影響，并驗證赤霉素和脫落酸影響二色補血草的Na+分泌作用是通過影響H+-ATPase和Na+:K+:Cl-共轉運體表達量而實現的；
　　5首次構建二色補血草對照與200 mmol L-1NaCl處理下的數字基因差異