沙咪珠利對柔嫩艾美爾球蟲誘導耐受及耐受機制研究.pdf

1、雞球蟲病是由艾美爾屬球蟲引起的一種原蟲病，能夠導致雞的生長發(fā)育緩慢并制約養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。目前，藥物治療是控制雞球蟲病的主要方法。隨著藥物的廣泛使用，雞球蟲幾乎對所有的抗球蟲藥物都產生了耐藥性。為了更好的控制雞球蟲病，研究雞球蟲對抗球蟲藥物的耐藥機制和探索藥物作用靶點是勢在必行的。沙咪珠利是由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所自主研發(fā)的具有良好抗球蟲活性的新型抗球蟲藥物，有良好的應用前景。
　　為了探索柔嫩艾美爾球蟲對沙咪珠利的耐藥機制，我

2、們研究了不同給藥劑量和盲腸組織中沙咪珠利的濃度關系，誘導了耐藥蟲株，并對敏感蟲株和耐藥蟲株進行了蛋白組和轉錄組學研究，以及兩組學的聯合分析。此外，對沙咪珠利溶液劑在雞體內的藥代動力學進行了研究，為其能夠在臨床中合理應用提供指導和參考。具體結果如下:
　　1.應用超高效液相色譜(UPLC)法建立了雞盲腸組織中沙咪珠利的含量測定方法，研究給藥劑量和雞盲腸組織中藥物含量的定量關系。將不同劑量的沙咪珠利添加到飼料中，雞自由采食8d后采集盲

3、腸組織，勻漿，乙酸乙酯提取，UPLC進樣檢測。色譜柱為ACQUITYUPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)，流動相為乙腈和水，梯度洗脫，檢測波長為251nm，柱溫30℃，流速0.2mL/min。在該檢測方法下，沙咪珠利在0.025-0.5μg/g和0.5-16.5μg/g的范圍內線性關系良好，線性方程分別為Y=6.2156X-0.0222(R2=0.9994)和Y=1.3445X-0.1544(R2=0.9999)

4、。高、中、低濃度的樣品平均回收率在85％～106％之間，批內和批間RSD均在10％以內。用該方法跟蹤不同給藥劑量下盲腸組織中沙咪珠利的含量，在給藥后第8d，隨著給藥劑量的增加，盲腸組織中藥物濃度增加幅度減小，為進一步研究球蟲對沙咪珠利產生的耐藥性機制提供參考。
　　為了研究沙咪珠利溶液劑在雞體內的藥代動力學特征，建立了檢測雞血漿中沙咪珠利的檢測方法。按照低(0.67mg/kg)、中(1.33mg/kg)、高(6.67mg/kg)三

5、個劑量單次灌服。利用藥代動力學軟件DAS3.0的非房室模型對血藥濃度時間數據進行分析。在給藥后5.17±1.80，4.6±2.12，4.6±2.12h分別達到最大血藥濃度2.16±0.57，3.91±0.71，23.71±5.02mg/L;消除半衰期分別為10.8，10.7和13.3h。結果表明:溶液劑中沙咪珠利在雞體內吸收快，消除緩慢，最大血藥濃度和藥時曲線下面積與給藥劑量呈正相關關系。
　　2.采用固定劑量法和逐漸遞增劑量法，

6、對沙咪珠利進行耐藥株的誘導，經過26次傳代分別獲得了對10mg/kg沙咪珠利和對200mg/kg沙咪珠利完全耐藥的蟲株。在第4代對傳代球蟲進行了單卵囊的分離與鑒定，鑒定結果表明:用于傳代的球蟲均為柔嫩艾美爾球蟲。將耐藥蟲株在飼料中不添加任何藥物的情況下傳代，誘導耐藥逆轉株。在第10代時，固定劑量逆轉株對10mg/kg的沙咪珠利仍然耐藥;逐漸遞增劑量組逆轉株對10mg/kg的沙咪珠利敏感。說明逐漸遞增劑量組誘導獲得的耐藥性在不用藥的情況下

7、比固定劑量組獲得的耐藥性更容易恢復。
　　3.利用蛋白質非標記定量技術對沙咪珠利敏感的柔嫩艾美爾球蟲蟲株和兩種方法誘導的耐藥株進行了蛋白組學分析，篩選差異蛋白，并對差異蛋白進行功能分析?？偣茶b定了1384個蛋白和7618條肽段;固定劑量耐藥株(R10)和敏感株(C)，逐漸遞增劑量耐藥株(R200)與敏感株，逐漸遞增劑量耐藥株和固定劑量耐藥株分別有222，573，620個差異蛋白。相對于敏感株，在固定劑量耐藥株和逐漸遞增劑量耐藥株中

8、有共同表達趨勢蛋白96個，主要與復制、入侵、膜組分、運輸和糖代謝等有關，說明球蟲的耐藥機制是比較復雜的，并不依賴于單一因素，為進一步研究球蟲的耐藥性機制提供新的思路。
　　4.利用RNA-Seq技術對沙咪珠利敏感的柔嫩艾美爾球蟲蟲株和兩種方法誘導的耐藥株進行轉錄組分析，篩選差異基因，并對其進行功能分析。R10vs C組有差異基因118個，上調42個，下調76個;R200vs C有1821個顯著差異基因，上調690個，下調1131個

9、;R200vs R10有1383個顯著差異基因，上調525個，下調858個。在R10vs C和R200vs C中都顯著差異，且上下調趨勢一致的有48個，上調11個，下調37個。另外在R10vs C和R200vs C中上下調趨勢一致，但在R10vs C中差異不顯著，在R200vs C中差異顯著的有1359個，上調480個，下調879個。差異基因主要參與細胞過程，代謝過程，是細胞器和膜的主要組成部分，主要發(fā)揮結合和催化功能等，為進一步研究球

10、蟲的耐藥機制奠定基礎。
　　5.將蛋白組和轉錄組結果進行整合分析，兩組學的相關性差，說明轉錄后加工，翻譯后修飾等影響轉錄組和蛋白組相關性的因素可能與耐藥性的形成有關。大部分差異基因/蛋白主要與代謝過程、細胞過程，結合、催化活性、細胞器和膜組分相關;主要參與的代謝通路，抗生素的生物合成，次級代謝物的生物合成，碳代謝，不同環(huán)境中的微生物代謝等通路。為探索球蟲耐藥機制提供參考和指導，具有重要意義。
　　綜上所述，該研究讓我們對柔嫩