甜瓜屬主要物種比較染色體圖譜的初步構(gòu)建及染色體進(jìn)化分析.pdf

1、甜瓜屬（Cucumis）包含52個(gè)種，其中包括黃瓜（C.sativus L.，2n=14）與甜瓜（C.melo L.，2n=24）兩個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)作物，以及許多重要的野生種，例如酸黃瓜(C.hystrix Chakr.，2n=24)、非洲角（C.metuliferus，2n=24）及西印度黃瓜（C.anguria,2n=24）等。甜瓜屬豐富的基因資源為作物的改良提供了寶貴的基因庫(kù)，物種間進(jìn)化關(guān)系的闡明對(duì)于利用甜瓜屬資源進(jìn)行作物的遺傳改良具

2、有重要的作用。目前，甜瓜屬中僅有黃瓜和甜瓜這兩個(gè)物種具有基因組測(cè)序信息，其它野生資源的分子信息仍非常有限，因此利用分子生物學(xué)信息進(jìn)行甜瓜屬物種間進(jìn)化關(guān)系的研究仍不易開(kāi)展?；跓晒庠浑s交（FISH）的比較染色體作圖能直觀地反映近緣物種間的染色體重排，揭示物種間的進(jìn)化關(guān)系，這對(duì)于分子遺傳基礎(chǔ)研究較為薄弱的甜瓜屬物種尤為重要。近年來(lái)，甜瓜屬物種之間的比較染色體研究正處于起步階段，大多只是針對(duì)黃瓜與甜瓜染色體的初步比較，對(duì)于野生種在甜瓜屬中的

3、比較進(jìn)化研究仍未涉及。本論文中，首先利用基因組原位雜交（GISH）的方法對(duì)黃瓜兩個(gè)變種的核型進(jìn)行了分析;其次，又分析了甜瓜屬5個(gè)物種（黃瓜、甜瓜、酸黃瓜、非洲角及西印度黃瓜）串聯(lián)重復(fù)序列(TRS)的分布與染色體結(jié)構(gòu)的關(guān)系，初步揭示了這5個(gè)物種TRS的同源性;最后，為了更深入地研究物種之間的進(jìn)化關(guān)系，提出了基于單拷貝基因的染色體涂染(ScgCP)技術(shù)，利用該技術(shù)初步構(gòu)建了黃瓜與甜瓜的比較染色體圖譜，為它們之間的進(jìn)化關(guān)系提供了細(xì)胞學(xué)依據(jù)。主

4、要研究結(jié)果如下:
　　1.利用基因組原位雜交快速構(gòu)建黃瓜變種間核型
　　利用GISH技術(shù)，對(duì)黃瓜（C.sativus L.，2n=14）種內(nèi)兩個(gè)變種（栽培黃瓜C.sativusvar sativus和野生黃瓜C.sativus var hardwickii）的中期染色體進(jìn)行分析，為構(gòu)建變種間核型提供了新的參考，并為黃瓜細(xì)胞分子遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。以栽培黃瓜‘9930’基因組DNA（genomic DNA，gDNA）為探針，分

5、別在栽培黃瓜和野生黃瓜的中期染色體上進(jìn)行GISH實(shí)驗(yàn)，根據(jù)GISH的熒光帶型，結(jié)合45SrDNA位點(diǎn)信號(hào)，區(qū)分每條染色體，并進(jìn)行核型分析。結(jié)果顯示，黃瓜基因組在兩個(gè)變種染色體上分別呈現(xiàn)出獨(dú)特的信號(hào)分布模式，信號(hào)強(qiáng)弱分別也表現(xiàn)出固有的明顯特征，通過(guò)信號(hào)的分布模式與強(qiáng)弱，清晰地對(duì)每條染色體進(jìn)行了識(shí)別，據(jù)此建立了兩個(gè)變種的核型模式圖。比較黃瓜現(xiàn)有重復(fù)序列的分布圖，發(fā)現(xiàn)GISH揭示的信號(hào)分布主要位于黃瓜染色體TRS區(qū)域。
　　2.基于比較

6、細(xì)胞遺傳圖譜初步揭示甜瓜屬主要物種的進(jìn)化關(guān)系
　　基于比較細(xì)胞遺傳圖譜，可以闡明基因組中重復(fù)序列的分布與差異，從而可以揭示甜瓜屬物種的進(jìn)化關(guān)系。以5個(gè)甜瓜屬物種（黃瓜、甜瓜、酸黃瓜、非洲角及西印度黃瓜）自身的gDNA與TRS為探針，利用GISH與FISH技術(shù)分析了甜瓜屬物種染色體結(jié)構(gòu)與TRS分布的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每個(gè)物種呈現(xiàn)出獨(dú)特的帶型，其中甜瓜與西印度黃瓜中大多數(shù)TRS主要定位在著絲粒異染色質(zhì)區(qū)域，在栽培黃瓜、酸黃瓜與非洲角中T

7、RS優(yōu)先分布在亞端粒區(qū)域，在栽培黃瓜、酸黃瓜與非洲角中TRS優(yōu)先分布在亞端粒區(qū)域。進(jìn)而，分別利用不同物種的gDNA為探針進(jìn)行比較GISH(cGISH)，發(fā)現(xiàn)黃瓜與酸黃瓜的TRS可能存在很高的同源性。進(jìn)一步利用來(lái)源于黃瓜的特定重復(fù)序列TypeⅠ/Ⅱ與TypeⅣ進(jìn)行了比較定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在黃瓜與酸黃瓜的近端粒區(qū)域均產(chǎn)生了很強(qiáng)的信號(hào)，由此推測(cè)這兩個(gè)物種存在同源性較高的TRS，這在一定程度上表明，黃瓜與酸黃瓜的親緣關(guān)系相對(duì)較近。根據(jù)甜瓜gDNA在

8、不同物種中的cGISH結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在每個(gè)物種的近著絲粒異染色質(zhì)區(qū)域有明顯的信號(hào)，表明這些區(qū)域可能存在保守的TRS。進(jìn)而，基于栽培黃瓜與甜瓜的基因組草圖分析了染色體上基因密度與GISH信號(hào)的關(guān)系。結(jié)果表明，在基因密度較低的區(qū)域具有明亮的GISH信號(hào)，在基因密度較高的區(qū)域出現(xiàn)了非常弱的GISH信號(hào)。以上結(jié)果表明，在甜瓜屬物種形成過(guò)程中重復(fù)序列存在明顯的分化。
　　3.黃瓜單拷貝基因的染色體涂染技術(shù)的開(kāi)發(fā)及其在甜瓜屬物種染色體研究中的應(yīng)用

9、
　　基于FISH的染色體涂染在染色體識(shí)別、染色體重排研究、染色體畸形的診斷，以及在人類和動(dòng)物物種進(jìn)化中扮演著重要的角色。然而，由于植物染色體中含有大量分散的重復(fù)序列，利用顯微切割技術(shù)分離的單染色體進(jìn)行涂染無(wú)法得到有效的應(yīng)用。在本研究中，首次提出了基于單拷貝基因FISH的染色體涂染技術(shù)—ScgCP，并應(yīng)用于甜瓜屬物種，最小檢測(cè)片段為2 kb?；谠摷夹g(shù)，以黃瓜單拷貝基因?yàn)樘结槪瑯?gòu)建了黃瓜中期染色體核型;利用間隔小于300 kb的連