小鼠ICSI新技術(shù)及其用于提高人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的研究.pdf

1、胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)是20世紀(jì)80年代發(fā)展的一種新型輔助生殖技術(shù),其實(shí)質(zhì)就是用注射針攜帶單個(gè)精子直接注入到卵子胞漿內(nèi)從而帶到受精的目的。ICSI的建立為許多不孕不育夫婦帶來(lái)了福音,目前已成為治療男性不育的一種常規(guī)治療手段。然而由于缺少合適的動(dòng)物模型,阻礙了人類(lèi)ICSI研究。小鼠卵子是一個(gè)非常理想化的ICSI動(dòng)物模型,但因小鼠卵子體積較小、抗損傷能力弱等原因,小鼠I

2、CSI研究進(jìn)展緩慢。直到1995年Kimura等人將Piezo儀器用于小鼠卵ICSI,才獲得了較高的鼠卵成活率、受精率及囊胚率。然而,由于Piezo-ICSI效果不穩(wěn)定且存在潛在的汞污染而限制了其在臨床及科研上的應(yīng)用。
　　 本文是對(duì)一項(xiàng)新研發(fā)的ICSI技術(shù)(New-ICSI,N-ICSI)的應(yīng)用和改進(jìn)。N—ICSI的方法為:將固定針做成喇叭狀的開(kāi)口,先用固定針吸入部分透明帶及胞質(zhì),然后直接用常規(guī)的尖口注射針插入卵胞質(zhì)中,進(jìn)行抽

3、吸破膜并注射精子?，F(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納如下:
　　 ①比較卵子行N-ICSI和C-ICSI的體外發(fā)育情況。實(shí)驗(yàn)表明,與常規(guī)的鼠卵注射方法(C-ICSI)相比,N-ICSI可以極其顯著提高鼠卵ICSI后成活率(22％vs89％,P<0.01)。鼠卵行N-ICSI的正常受精率、卵裂率及桑椹胚率分別為85％、71％和61％,與C-ICSI差異不顯著(88％、84％、76％,P>0.05)。N-ICSI和C-ICSI的囊胚率差異也不顯著(6

4、5％vs62％,P>0.05),但都顯著低于激活組(97％,P<0.05)。優(yōu)化和改善N-ICSI的實(shí)驗(yàn)條件,也許可以提高成囊率。
　　 ②比較固定針開(kāi)口內(nèi)徑及固定針吸入胞質(zhì)長(zhǎng)度這兩個(gè)主要參數(shù)的不同組合對(duì)囊胚率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)固定針為45μm的時(shí)候,卵子的成活率較低(64％)顯著低于固定為50μm或55μm的卵成活率。而當(dāng)吸入胞質(zhì)長(zhǎng)度為75μm時(shí),成囊率(0％和33％)顯著低于大部分其他組合,或者正常受精率極低(只有36％,其

5、余為三倍體或多倍體)。而當(dāng)固定針內(nèi)徑為55μm,胞質(zhì)吸入長(zhǎng)度為40μm時(shí),卵子成活率、正常受精率、囊胚率。與內(nèi)徑為45μm吸長(zhǎng)40μm相當(dāng),但內(nèi)徑為55μm的卵裂率明顯低于內(nèi)徑為50μm的卵裂率。而當(dāng)固定針內(nèi)徑為50μm,胞質(zhì)吸入長(zhǎng)度為40μm,可得到可觀的成活率,正常受精率,卵裂率,桑椹胚率和囊胚率,故將該組參數(shù)視為最佳N-ICSI條件。
　　 ③建立大批量小鼠卵子冷凍技術(shù),每個(gè)載體可以裝載20-50個(gè)卵子。將人精子注射(N-

6、ICSI)到這些解凍復(fù)蘇的小鼠卵子中并結(jié)合臨床ICSI資料,可以判定部分臨床ICSI過(guò)程失敗的原因。
　　 ④將N—ICSI最佳條件用于人精子注射鼠卵的跨物種ICSI,比較不同的人精子制動(dòng)時(shí)間對(duì)鼠卵激活能力的影響。實(shí)驗(yàn)表明:用人精子對(duì)鼠卵行N-ICSI,可得到80％以上的成活率、90％以上的受精率和70％的卵裂率；并發(fā)現(xiàn)人精子在制動(dòng)30min內(nèi)激活鼠卵的能力沒(méi)有發(fā)生變化。
　　 以上結(jié)果表明,本研究建立了一種高效、便捷、