輔助生殖技術(shù)中提高胚胎移植效率的相關(guān)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 不同移植方案對(duì)胚胎移植效率的影響分析
　　目的:體外受精-胚胎移植過程中，在促排卵后，針對(duì)正常卵巢反應(yīng)患者和卵巢高反應(yīng)患者（獲卵數(shù)＞15個(gè)），分析選擇采用何種移植方案既能獲得理想的臨床妊娠率，又能有效減少并發(fā)癥和多胎妊娠的發(fā)生。
　　方法:將采用長(zhǎng)方案進(jìn)行超促排卵的患者納入研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)包括:原發(fā)不孕、女方年齡≤35歲，取卵后第三天(D3)優(yōu)胚數(shù)≥6枚。根據(jù)獲卵數(shù)將患

2、者分為兩類:一類是正常卵巢反應(yīng)患者（獲卵數(shù)6～15個(gè)）;另一類是卵巢高反應(yīng)患者（獲卵數(shù)大于15個(gè)）。從胚胎培養(yǎng)室的角度將移植方案設(shè)定為三種:第一種為新鮮周期D3卵裂期雙胚移植，第二種為選擇新鮮周期取卵后第五天(D5)單囊胚移植;第三種為新鮮周期不移植，行冷凍囊胚復(fù)蘇后移植的患者。根據(jù)臨床結(jié)局，回顧性分析不同胚胎移植方案對(duì)臨床結(jié)局的影響。
　　結(jié)果:1）對(duì)于卵巢正常反應(yīng)患者，D3天卵裂期雙胚胎移植與D5天選擇性單囊胚移植具有相似的臨

3、床妊娠率(64.04％ vs.60.33％，p＞0.05)，但單囊胚移植的多胎率極其顯著的低于D3雙胚胎移植(4.11％ vs.35.62％，p＜0.01)。2)采用D5單囊胚移植，卵巢高反應(yīng)患者的臨床妊娠率明顯低于卵巢正常反應(yīng)患者(43.35％vs.60.33％，p＜0.05)。3)對(duì)于卵巢高反應(yīng)患者，采用冷凍囊胚移植比新鮮周期囊胚移植可獲得更高的臨床妊娠率和著床率(60.60％ vs.43.35％和60.60％ vs.43.35％，

4、p＜0.05)。
　　結(jié)論:對(duì)于卵巢正常反應(yīng)患者，新鮮周期選擇性單囊胚移植既能保證臨床妊娠率又能有效降低多胎妊娠的發(fā)生。而對(duì)于卵巢高反應(yīng)患者，建議采用凍胚移植方案提高妊娠率。
　　第二部分 體外受精-胚胎移植過程中囊胚培養(yǎng)對(duì)胚胎性別偏離的影響
　　目的:探討體外受精-胚胎移植過程中常規(guī)囊胚培養(yǎng)對(duì)新鮮囊胚移植周期(D5胚胎)性別出生比例偏離的影響及發(fā)生這種偏離的可能原因。
　　方法:選擇2013年3月至2014年8

5、月在山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院行體外受精-胚胎移植技術(shù)的患者，將符合移植標(biāo)準(zhǔn)或冷凍標(biāo)準(zhǔn)的胚胎均進(jìn)行移植或冷凍，將剩余的放棄并捐獻(xiàn)科研的胚胎根據(jù)不同的類型進(jìn)行單個(gè)胚胎收集，并通過PCR進(jìn)行胚胎的性染色體特異序列檢測(cè)。與國內(nèi)多中心輔助生殖技術(shù)出生嬰兒的結(jié)局以及本中心2012和2013年進(jìn)行冷凍復(fù)蘇周期囊胚移植后出生嬰兒的結(jié)局進(jìn)行對(duì)比。另外采用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)IVF(In vitro fertilization)患者精子樣本處理前后X精子和

6、Y精子比例，并進(jìn)行對(duì)比分析。
　　結(jié)果:1）IVF/ICSI過程中，對(duì)準(zhǔn)備授精預(yù)處理前的精子和處理后的精子，行Y/X比例檢測(cè)發(fā)現(xiàn)處理后的Y精子與X精子的比例顯著的低于男性外周血淋巴細(xì)胞性染色體特異序列檢測(cè)基準(zhǔn)比值(0.68∶1 vs.0.83∶1，P＜0.01)（理論數(shù)值應(yīng)為1∶1;0.83∶1是鑒于微滴式數(shù)字PCR的系統(tǒng)誤差校正后的比值，同一儀器對(duì)精子DNA的檢測(cè)以此為參照），也低于處理前的Y精子與X精子的比例(0.68∶1 v

7、s.0.76∶1，P＜0.01)。2)IVF周期剩余胚胎的男性比率52.94％; ICSI(Intracytoplasmic sperm injection)周期剩余胚胎的男性比率為47.59％，與多中心的生產(chǎn)結(jié)局相比均沒有顯著性差異（多中心IVF后男性比率為52.33％，;ICSI后男性比率為49.73％），說明選擇剩余胚胎作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象對(duì)后續(xù)分析無明顯影響，且ICSI人工操作未造成男性比例增加。3）冷凍囊胚（D5-D6）移植與新鮮周期

8、D3胚胎移植相比，生產(chǎn)結(jié)局的男性比例之問沒有顯著性差異(52.33％ vs.53.70％，P＞0.05)。冷凍囊胚移植與新鮮周期卵裂期胚胎移植相比沒有產(chǎn)生明顯的性別偏移，說明囊胚培養(yǎng)后形成囊胚的整體性別無明顯偏移，文獻(xiàn)報(bào)道的新鮮囊胚移植后性別發(fā)生偏移需要從胚胎選擇時(shí)間等其他方面進(jìn)行研究。
　　結(jié)論:采用囊胚培養(yǎng)技術(shù)本身并沒有導(dǎo)致男性胚胎更易發(fā)育成囊胚，因此不會(huì)導(dǎo)致整體囊胚性別比例的改變。文獻(xiàn)報(bào)道新鮮周期囊胚移植后嬰兒出生比例向男性

9、偏移需要從新鮮囊胚的挑選時(shí)機(jī)等方面探討原因。IVF周期胚胎及出生嬰兒性別比較ICSI周期存在向男性偏移的傾向，但導(dǎo)致該趨勢(shì)的原因不來自于授精時(shí)Y精子的數(shù)量比例。
　　第三部分 改良的胚胎卵裂球固定方法對(duì)熒光原位雜交過程中固定率和探針雜交效果的影響
　　目的:熒光原位雜交(Fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)用于胚胎植入前遺傳學(xué)診斷，其有效性很大程度取決于卵裂球或滋養(yǎng)層細(xì)胞的固定率

10、和探針雜交效果。卵裂球細(xì)胞的固定率取決多個(gè)方面的因素，論文該部分的研究主要目的是評(píng)價(jià)改良的固定方法對(duì)固定率和探針雜交效果的影響，同時(shí)分析胚胎質(zhì)量與FISH結(jié)果的相關(guān)性。
　　方法:采用tween20+甲醇冰醋酸作為卵裂球固定液，在傳統(tǒng)固定流程的基礎(chǔ)上，對(duì)固定液使用的時(shí)機(jī)及方式做了改良。采用傳統(tǒng)的固定方法和本課題組改良的固定方法分別對(duì)2012年2月至2015年1月在山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院用FISH技術(shù)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的患者進(jìn)行胚

11、胎的卵裂球固定操作。同時(shí)根據(jù)胚胎的質(zhì)量評(píng)分進(jìn)行分類、統(tǒng)計(jì)和分析。按照形態(tài)學(xué)評(píng)分將胚胎分為優(yōu)質(zhì)胚胎（形態(tài)學(xué)評(píng)分≥3分）與非優(yōu)質(zhì)胚胎（形態(tài)學(xué)評(píng)分為2分以下），在用常規(guī)的卵裂球固定方法和改進(jìn)的卵裂球固定方法時(shí)，對(duì)不同評(píng)分級(jí)別的胚胎所來源的卵裂球的最終固定率、信號(hào)率及完全信號(hào)率進(jìn)行對(duì)比。
　　結(jié)果:本課題組共納入研究的胚胎2939枚。1）與常規(guī)固定方法相比，用改進(jìn)的卵裂球固定方法后，改進(jìn)組與常規(guī)組的固定率之間沒有顯著性差異(92.02％v

12、s.91.17％，p=0.4377)，但改進(jìn)組的信號(hào)檢出率要顯著的高于常規(guī)組(99.02％vs.85.16％，p＜0.001)，改進(jìn)組的每種探針完全信號(hào)率（去除理論上完全不可能出現(xiàn)的零探針信號(hào)）也顯著的高于常規(guī)組(91.79％vs.77.80％，p＜0.001)。2)用常規(guī)的卵裂球固定方法進(jìn)行卵裂球固定，優(yōu)質(zhì)胚胎的固定率/核擴(kuò)展率要明顯的高于非優(yōu)質(zhì)胚胎(92.52％VS.87.62％，p=0.0007);完全信號(hào)率亦明顯高于非優(yōu)質(zhì)胚胎(

13、79.32％VS.65.05％，p＜0.001);兩組之間的出信號(hào)率沒有顯著的差別(85.60 vs.83.94％，p=0.3855)。3)用改進(jìn)的卵裂球固定方法后，優(yōu)質(zhì)胚胎卵裂球的固定率顯著高于非優(yōu)質(zhì)胚胎卵裂球的固定率(93.61％VS.87.90％，p=0.0027);信號(hào)檢出率和完全信號(hào)率方面，優(yōu)質(zhì)胚胎與非優(yōu)質(zhì)胚胎組之間沒有顯著性差異(99.56％vs.97.57％，P=0.0066;91.96％vs.91.29％，P=0.743