miR208b、328、145和155在大鼠H9c2細(xì)胞和ACS患者中的表達(dá)及意義.pdf

1、背景與目的：
　　 急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndrome，ACS)是一組由急性心肌缺血引起的臨床綜合征，是常見(jiàn)的心血管疾病之一，包括不穩(wěn)定心絞痛（unstableangina，UAP）、非ST段抬高心肌梗死(Non-ST-segmentelevationmyocardialinfarction，NSTEMI)和ST段抬高心肌梗死(ST-segmentelevationmyocardialinfarction

2、，STEMI)，具有較高的致殘率和致死率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。ACS的早期診斷，尤其在心肌沒(méi)有發(fā)生壞死的可逆階段，對(duì)提高患者的生存率及生活質(zhì)量極為重要。目前，肌鈣蛋白（CTnT或CTnT）的測(cè)定是診斷急性心肌梗死特異性強(qiáng)和靈敏度高的標(biāo)志物之一，但在患者發(fā)生胸痛6h內(nèi)，CTnT/I可能由于靈敏度不高，在早期診斷方面受到限制，篩選新的心肌標(biāo)志物用于ACS診斷具有重要意義。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)微小RNA(microRNA，miR

3、NAs，miRs)可以輔助多種系統(tǒng)疾病的早期診斷。
　　 MiRNAs于1993年在線蟲體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)，是一類長(zhǎng)度約為18-25核苷酸的小分子RNA，其結(jié)構(gòu)為非編碼單鏈分子。在動(dòng)植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種miRNAs的存在，其功能主要通過(guò)降解靶mRNA或者抑制蛋白質(zhì)的翻譯，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化與凋亡;與個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝、多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，miRNA在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)能夠以某種機(jī)制穩(wěn)定存在于人類及動(dòng)物的血液、唾液、尿

4、液等體液中，可能作為生物標(biāo)志物用于腫瘤、代謝性疾病、組織損傷、炎癥疾病等多種疾病臨床診斷。報(bào)道顯示miR208b與心肌纖維、心肌肥厚、心力衰竭及心肌缺血發(fā)生有關(guān);miR145與血管平滑肌細(xì)胞分化有關(guān);miR-155表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，參與動(dòng)脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、心肌肥厚及心肌梗死的病理生理過(guò)程，并與血管重塑有關(guān);miR328作為多種病理生理過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，不僅在心血管疾病中表達(dá)，其他疾病，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、阿爾茨海默病、

5、原發(fā)性膽汁性肝硬化、乳腺癌耐藥性等也有異常表達(dá)。但是miR208b，miR328，miR145和miR155是否參與ACS發(fā)病，在ACS病程中的表達(dá)如何變化，仍需進(jìn)一步研究。
　　 基于上述研究背景，本研究做出以下假設(shè):上述miRNAs在ACS發(fā)生心肌缺血時(shí)可能以某種形式釋放到血液中，使血液中相應(yīng)miRNAs的水平發(fā)生變化，成為心肌細(xì)胞損傷的臨床輔助診斷指標(biāo)。針對(duì)以上假設(shè)本課題進(jìn)行如下研究:(1)在體外采用大鼠H9c2細(xì)胞，用T

6、ritonX-100破壞大鼠H9c2心肌細(xì)胞，觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清液中miR208b，miR328，miR145，miR155和乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase，LDH)的變化趨勢(shì)和表達(dá)量改變，從體外細(xì)胞水平提供miR208b，miR328，miR145和miR155作為一個(gè)心肌損傷診斷的可能依據(jù)。(2)進(jìn)一步檢測(cè)ACS患者血漿miR208b，miR328，miR145和miR155的表達(dá)水平，并檢測(cè)患者血漿中的心肌損傷指

7、標(biāo)如CK-MB、CTnT等的表達(dá)水平，為揭示上述miRNAs在ACS診斷中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 (1)采用不同濃度（0.10％，1.00％及2.00％）的TritonX-100處理大鼠H9c2心肌細(xì)胞，建立心肌細(xì)胞壞死模型。
　　 (2)細(xì)胞分組:PBS處理組、0.10％TritonX-100處理組、1.00％TritonX-100處理組及2.00％TritonX-100處理組，每組6孔。

8、r>　　 (3)臨床分組:ACS患者50例為ACS組，包括20例UAP組及30例AMI組;對(duì)照組為16例健康體檢者。
　　 (4)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血漿中的LDH、肌鈣蛋白(CTnT)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)及其他生化指標(biāo)，MTT法測(cè)定細(xì)胞增值情況。
　　 (5)采用2-△△Cr實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(quantitativereal-timePCR，qRT-PCR)定量測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液及血漿中上述miRNA

9、s的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)上清液PBS組與處理組心肌增殖、損傷及上述miRNAs表達(dá)水平比較:
　　 (1)MTT結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，隨著TritonX-100作用濃度的升高，心肌細(xì)胞H9c2的存活率分別為（100％，71％，23％和16％），呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　 (2)與PBS處理組比較，細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH表達(dá)量分別為(7.86±1.98、26.55±8.46、

10、54.32±9.96、74.1±4.68)U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (3)與PBS處理組比較，細(xì)胞培養(yǎng)上清液CK-MB的表達(dá)量為(60.42±10.4、120.5±12.78、156.2±10.5、160.3±14.9)U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (4)與PBS處理組比較，細(xì)胞培養(yǎng)上清液miR208b、miR328及miR155相對(duì)表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

11、;miR145相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。除miR208b、miR155及miR328與LDH表達(dá)量呈相關(guān)性(P＜0.05);miR-208b與CK-MB表達(dá)量呈相關(guān)性（P＜0.05）。
　　 (5)細(xì)胞培養(yǎng)上清液miR-208b在6h，12h及24h表達(dá)水平為(19.3±3.25，18.7±2.36，18.21±1.21和18.1±2.3)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2、ACS組及對(duì)照組

12、上述miRNAs表達(dá)水平及比較:
　　 (1)ACS組血漿miR208b表達(dá)量為(265.70±256.24)，miR328表達(dá)量為（8.12±3.81），與對(duì)照組表達(dá)量(1.00±0.00)比較顯著上調(diào)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (2)ACS組血漿miR145表達(dá)量為(0.21±0.12)，與對(duì)照組表達(dá)量(1.00±0.00)比較顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (3)AC

13、S組血漿miR155表達(dá)量為(1.00±0.26)，與對(duì)照組表達(dá)量(1.00±0.00)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3、AMI組與UAP組上述miRNAs表達(dá)水平及比較:
　　 (1)AMI組血漿miR208b表達(dá)量為(442.16±174.38)，UAP組表達(dá)量未檢測(cè)出，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AMI組血漿miR328表達(dá)量為（10.69±2.17），UAP組表達(dá)量為（4.26±2.0

14、6），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (2)AMI組血漿miR145表達(dá)量為（0.19±0.10），UAP組表達(dá)量為（0.25±0.14），兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AMI組miR155表達(dá)量為(1.02±0.28)，UAP組表達(dá)量為（0.96±0.22），兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)隨著TritonX-100濃度的增加，大鼠H9c2心肌細(xì)胞壞死數(shù)量增加，細(xì)胞上清液