PRRSV重組NSP7蛋白ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、目前,豬繁殖與呼吸綜合征依然是世界養(yǎng)豬業(yè)的一大難題。豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因組長(zhǎng)約15KB,為單正鏈RNA病毒,它含8個(gè)開(kāi)放閱讀框,編碼nsp7蛋白的基因是ORF1,該基因位于基因組的5’端。目前的研究表明NSP7蛋白是一個(gè)可用于檢測(cè)PRRSV血清抗體的理想蛋白,其具備以下幾個(gè)特征:NSP7蛋白以可溶性蛋白的方式進(jìn)行表達(dá),利于蛋白的表達(dá)與純化。在檢測(cè)分析大量樣本時(shí),能夠提供足夠的抗原;NSP7蛋白在同一基因型中有很高的同源性;PRR

2、SV感染后機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的抗nsp7抗體的水平很高,可持續(xù)到202天以后。
　　 設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR的方法從PRRSV BJ-4毒株中擴(kuò)增得到nsp7基因,將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物連接至表達(dá)載體pET28a。將重組質(zhì)粒pET28a-nsp7轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)細(xì)菌中,鑒定并測(cè)序。進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,表達(dá)結(jié)果用SDS-PAGE分析。結(jié)果表明成功表達(dá)了分子量大小約為33 Kda的重組蛋白。表達(dá)蛋白用Ni-NTA樹(shù)脂進(jìn)行純化,We

3、stern blot分析,表明重組蛋白具有良好的抗原性。
　　 以重組nsp7蛋白為檢測(cè)抗原,建立了檢測(cè)PRRSV抗體的ELISA試劑盒。對(duì)試劑盒進(jìn)行了符合研究,比較NSP7-ELISA和IDEXX試劑盒的檢測(cè)結(jié)果,二者的陽(yáng)性符合率為87.59％,陰性符合率為76%,重復(fù)率為86.9%,表明NSP7-ELISA有很高的敏感性和特異性。
　　 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pET28a-nsp7原核表達(dá)載體,并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)使目的