柑橘衰退病毒S45分離物的分子特點及蚜蟲傳播對CTV分子變種組成的影響.pdf

1、柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)在世界各柑橘產(chǎn)區(qū)均有分布,且存在株系分化,主要有莖陷點株系、速衰株系及苗黃株系,其中速衰株系在以酸橙為砧木的柑橘上可引起樹體的衰退,莖陷點株系引起葡萄柚和某些甜橙品種的莖陷點癥狀,病株果實變小、產(chǎn)量與品質(zhì)降低,因此對柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴重的威脅。CTV是長線形病毒科(Closteroviridae)長線形病毒屬(Closterovirus)成員,其基因組為全長約19.3 kb的

2、+ssRNA,為已知基因組最大的植物病毒。目前全世界已報道有15個CTV分離物的全基因組序列,根據(jù)各分離物的基因組序列特點,可劃分為5種基因型,即T30、VT、T36、T3和B165。為更深入了解我國發(fā)生的CTV的群體結(jié)構(gòu)及分子特點,本研究選取了具有高度變異的CTV分離物S45為主要研究對象,對其分子變異特性進行了研究,同時分析了蚜蟲傳播對分離物Z5的分子變種組成的影響,結(jié)果如下。
　　 1.根據(jù)已報道的CTV基因組結(jié)構(gòu)及序列設(shè)

3、計引物,采用RT-PCR技術(shù)對CTV分離物S45的全基因組分片段進行擴增,對各擴增產(chǎn)物進行了克隆,選取各擴增片段的克隆9-16個,采用PCR-SSCP方法進行分析的結(jié)果顯示,該CTV分離物是由多個分子變種組成的群體,各擴增片段均含有多種SSCP單體型,其單體型組成從2-6種不等。選取表現(xiàn)出不同SSCP帶型的克隆進行測序,序列比對的結(jié)果顯示,所擴增的各區(qū)域均存在一定分子變異,其中M2區(qū)域變異最大,克隆間的遺傳距離為0.255±0.019。

4、變異相對較小的是P27區(qū)域,克隆間的遺傳距離為0.033±0.007,而CP基因的變異很小,所測序的6個克隆間僅有2-4個堿基差異,遺傳距離為0.003±0.002。各克隆片段的序列與已報道的CTV分離物的序列比對分析的結(jié)果顯示,該分離物基因組的部分區(qū)域同時存在與弱毒株系T30及強毒株系NZRB-G90具有較高序列相似性的分子變種,部分克隆則與二者的序列相似性均相對較低,推測可能存在兩個株系間的重組。
　　 2.將相鄰片段所測得

5、的多個分子變種序列進行拼接,獲得一個全長為19243 nt的基因組序列(命名為S45-R)。核苷酸序列比對結(jié)果表明,S45-R與GenBank上已登錄的15個分離物的基因組全長序列相似性為80.0％-93.5％,與弱毒株系T30核苷酸序列相似性最高,為93.5％；但其CP基因與強毒株系NZRB—G90相似性最高,為97.2％,與T30為93.30％；P23蛋白在強弱毒株系鑒定的氨基酸位點則顯示出與弱毒株系一致的特點,該結(jié)果進一步表明CT

6、V分離物S45基因組內(nèi)存在重組現(xiàn)象。采用RDP重組分析軟件包對S45-R進行重組分析,發(fā)現(xiàn)所獲全長序列內(nèi)存在8個潛在的重組區(qū)域,各重組區(qū)域均被3種或3種以上方法檢測到。其中RDP軟件包的7種分析方法均從位于11483-13744 nt區(qū)域(位于P33、P6和P653個基因內(nèi))檢測到重組事件,且均為極顯著(P值從1.216×10-148到8.315×10-27),其主要親本和次要親本分別為弱毒株系T30和強毒株系NZRB-G90。

7、　　 3.采用RT-PCR方法對本研究室保存的7個CTV分離物的CP基因進行擴增,選取擴增產(chǎn)物的陽性克隆進行PCR-SSCP分析,結(jié)果顯示分離物N4、N9和N25的擴增產(chǎn)物表現(xiàn)為單一的SSCP單體型,N3、N21、Z30的擴增產(chǎn)物表現(xiàn)為3種單體型組成的混合群體,Z5的擴增產(chǎn)物表現(xiàn)為7種單體型組成的混合群體,即分離物內(nèi)存在多個分子變種的混合侵染。選取種群結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的分離物Z5為毒源,采用棉蚜對20株甜橙實生苗進行傳毒,約3個月后進行病