勝紅薊黃脈病毒F1分離物伴隨衛(wèi)星小分子DNAβ的啟動(dòng)子鑒定.pdf

1、雙生病毒在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，并已在多種作物上造成毀滅性危害，國(guó)內(nèi)已報(bào)道和鑒定了30多種雙生病毒。本文以福建省首例發(fā)現(xiàn)的勝紅薊黃脈病毒AYVV(登錄號(hào)EF544600)為研究對(duì)象，通過雙生病毒衛(wèi)星小分子DNAβ的通用引物，PCR擴(kuò)增獲得AYVV-[F1]的完整DNAβ分子。經(jīng)克隆、序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明AYVV-[F1]DNAβ組分全長(zhǎng)1346個(gè)核苷酸，與臺(tái)灣番茄曲葉病毒TLCV DNAβ(登錄號(hào)AJ542495)的同源性最

2、高，達(dá)100％。根據(jù)F1 DNAβ的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物F1-βC1-F和F1-βC1-R對(duì)βC1基因進(jìn)行了克隆后再將該基因插入到原核表達(dá)載體pGEX-4T-3中。重組表達(dá)載體pGEX-F1-βC1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果表明F1βC1基因得到了正確表達(dá)。此外，根據(jù)F1 DNAβ基因組的序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)F1 DNAββC1 ORF的大小為803 nt的部分啟動(dòng)子序列進(jìn)行了克隆，

3、同時(shí)利用PlantCARE程序?qū)Ζ翪1 ORF啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，在其內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了一些真核啟動(dòng)子中常見的順式作用元件，如TATA-box，CAAT-box和GC-motif，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了其他的一些植物調(diào)控元件。隨后根據(jù)βC1 ORF啟動(dòng)子上順式作用元件的位置設(shè)計(jì)了多個(gè)不同大小的缺失啟動(dòng)子，并由這些缺失啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)egfp報(bào)告基因在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)和永久表達(dá)，鑒定了該啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性。對(duì)瞬時(shí)表達(dá)的western blot分析和熒光顯微鏡檢查表